Trennen Sie leere und volle AAV-Kapside mit MCSGP — Herstellung von Gentherapeutika.

Einstellung: AAV2-Reinigung aus HEK293-Zelllysat mittels Anionenaustauschchromatographie. Ausgangsmaterial mit einem anspruchsvollen Verhältnis von leeren/vollen Kapsiden.

Batch-AEX-Ausgangspunkt:

• Gehalt an vollen Kapsiden: ~30 % (ddPCR) / ~27 % (cryo-TEM)
• Produktverlust in Seitenfraktionen: signifikant – volle Kapside mit geringer Ausbeute zurückgewonnen

MCSGP-Ergebnis (6 Zyklen, gleiche AEX-Bedingungen):

• Gehalt an vollen Kapsiden: 68 % (ddPCR) / 61 % (cryo-TEM) – mehr als eine Verdoppelung der Reinheit voller Kapside
• Rückgewinnung voller Kapside: wesentlich höher als bei Batch – Ausbeute-Reinheit-Zielkonflikt überwunden
• Online-UV260/280-Verhältnisüberwachung: erfolgreiche Identifizierung der Übergangszone zwischen leeren und vollen Kapsiden in Echtzeit; bestätigt durch Offline-Multi-Angle Light Scattering (MALS) und cryo-TEM

Wichtigstes Ergebnis: Die MCSGP-Prozessentwicklung beginnt mit Ihrer validierten Batch-AEX-Methode – Harz, Puffer und Gradientenbedingungen bleiben erhalten. Das Online-UV260/280-Verhältnis liefert ein praktisches, reagenzfreies PAT-Signal, das für die AutoPeak®-Integration geeignet ist. Beide analytischen Techniken (ddPCR und cryo-TEM) bestätigten die Anreicherung – wodurch das UV-Verhältnis als zugängliches Prozessüberwachungstool für den Gehalt an vollen/leeren Kapsiden validiert wurde.

Müller, J. et al. Biotechnol. Bioeng. (2025). PubMed: 40468522

Einstellung: AAV2-Reinigung mittels Anionenaustauschchromatographie, Reinheitsspezifikation (Pspec) = 70,0 % volle Kapside.

Batch-AEX-Baseline:

• Ausbeute: ~10–11 % volle Kapside bei 70 % Reinheit
• Produktivität: 3,85×10¹³ VP/(L_Harz·h) mit 20 CV-Gradient
• Flache Gradienten (30 CV) verbessern die Ausbeute leicht (auf 11,3 %), reduzieren aber die Produktivität drastisch – ein schwieriger Kompromiss

MCSGP-Ergebnis (gleiches AEX-Harz, gleiche Pspec):

• Ausbeute: 57,8 % – ungefähr 5-fach höher als Batch
• Produktivität: 8,65×10¹³ VP/(L_Harz·h) – ungefähr 2,5-fach höher als der produktivitätsoptimierte Batch-Fall
• Prozessmassenintensität (PMI): reduziert auf 1/3 von Batch – 3-fache Reduzierung des Pufferverbrauchs
• Sowohl hohe Ausbeute als auch hohe Produktivität gleichzeitig erreicht – der Kompromiss eliminiert

Wichtigstes Ergebnis: MCSGP ist die einzige Technik, die gleichzeitig Ausbeute, Produktivität und Nachhaltigkeitsmetriken für die AAV-Trennung von leeren/vollen Kapsiden verbessert. Die Studie validierte die MCSGP-Leistung durch modellbasiertes Prozessdesign, wodurch der experimentelle Aufwand für den Methodentransfer erheblich reduziert wurde.

J. Chromatogr. A (2025). DOI: 10.1016/j.chroma.2025.465001

Für AAV-Programme, die kommerzielle Affinitätsharze verwenden (POROS CaptureSelect AAVX, AAV8, AAV9; Capto AVB; AVIPure®), erweitert CaptureSMB die zweisäulige periodische Gegenstromchromatographie auf den Aufreinigungsschritt – das gleiche Prinzip, das eine 2,5-fache Protein-A-Produktivität für mAbs liefert.

Im CaptureSMB-Modus arbeiten zwei Affinitätssäulen in einem koordinierten, miteinander verbundenen und parallelen Zyklus. Die erste Säule wird über ihren Single-Pass-Durchbruchpunkt hinaus beladen; jeder Durchbruch wird auf der zweiten Säule in Reihe aufgefangen. Dies überwindet eine zentrale Herausforderung der AAV-Affinitätsaufreinigung: geringe dynamische Bindungskapazität im Verhältnis zur großen Kapsidgröße (~25 nm) begrenzt die Harznutzung bei konventioneller Batch-Beladung.

Potenzielle Vorteile für die AAV-Affinitätsaufreinigung:

• Höhere Harznutzung – Beladung über den Durchbruchpunkt hinaus ohne Produktverlust
• Höhere Produktivität pro Säulenvolumen – relevant angesichts der hohen Kosten spezieller AAV-Affinitätsharze
• Reduzierter Pufferverbrauch – weniger Äquilibrierungszyklen pro aufgefangenem Gramm
• Geringerer Säulen-Footprint – wichtig in GMP-Umgebungen mit begrenztem Platz

CaptureSMB für die AAV-Affinitätsaufreinigung befindet sich in aktiver Entwicklung. Kontaktieren Sie unsere Anwendungsspezialisten für eine Machbarkeitsbewertung. Der CUBE unterstützt sowohl CaptureSMB als auch MCSGP und ist somit die ideale Plattform für die Entwicklung und den Vergleich beider Schritte auf demselben Instrument.

Ja – MCSGP ist auf jeden Serotyp anwendbar, bei dem die AEX-Gradientenchromatographie zumindest eine teilweise Trennung von leeren/vollen Kapsiden erreicht. Ein veröffentlichter Proof-of-Concept liegt für AAV2 vor (Müller et al. 2025; Grob et al. 2025). Der Contichrom CUBE ermöglicht eine schnelle Methodenanpassung an AAV5, AAV8, AAV9 und modifizierte Kapsidvarianten.

Nein. MCSGP verwendet das gleiche Anionenaustauschharz, Puffer und Gradientenbedingungen wie Ihre bestehende validierte Batch-AEX-Methode. Der Übergang von Batch zu MCSGP erfordert lediglich die Übertragung des Batch-Gradienten in eine MCSGP-Betriebsstrategie – die Anwendungsspezialisten von ChromaCon unterstützen dies als Teil der standardmäßigen Machbarkeitsbewertung.

AutoPeak® verwendet das Echtzeit-UV260/280-Absorptionsverhältnis als primäres PAT-Signal. Leere Kapside haben ein niedrigeres UV260/280-Verhältnis als volle Kapside. Wenn die Elution die gemischte Zone durchläuft, erkennt AutoPeak® die Verschiebung online und definiert automatisch die Grenzen des Recyclingfensters – bestätigt durch cryo-TEM und Multi-Angle Light Scattering (Müller et al. 2025).

Bei einer Reinheitsspezifikation von 70 % vollen Kapsiden erreichte MCSGP eine Ausbeute von ~58 % gegenüber ~10–11 % bei Batch – eine Verbesserung um das ~5-fache (Grob et al. 2025). Ausgehend von 30 % vollen Kapsiden erreichten Müller et al. (2025) einen Gehalt von 68 % vollen Kapsiden. Die erwarteten Ergebnisse für Ihr Programm hängen vom Ausgangsmaterial und der Zielreinheit ab; die Machbarkeitsbewertung von ChromaCon liefert molekülspezifische Prognosen.

In Müller et al. (2025) wurden 6 MCSGP-Zyklen zur Erzielung der berichteten Anreicherung verwendet. Die Anzahl der Zyklen und die Laufzeit hängen vom Feedvolumen, der Säulengröße, der Gradientenlänge und der Zielreinheit ab. Die Methodenentwicklung auf dem Contichrom CUBE dauert typischerweise ein bis wenige Tage. Die Dauer der Batch-Produktion im Herstellungsmaßstab wird im Rahmen einer Machbarkeitsstudie modelliert.

Die FDA-Richtlinien und ICH Q6B fordern die Charakterisierung des Kapsidgehalts als kritisches Qualitätsmerkmal. Viele Programme zielen auf ≥90 % volle Kapside im endgültigen Arzneimittel ab. MCSGP mit AutoPeak® ermöglicht eine reproduzierbare Anreicherung voller Kapside aus variablen Upstream-Feeds – dies unterstützt direkt die Chargenkonsistenz und die Einhaltung behördlicher Vorschriften.

Ja. Sowohl der CUBE als auch der TWIN LPLC unterstützen MCSGP und CaptureSMB auf derselben Hardware, umschaltbar über die ChromIQ®-Software. Ein einziges Instrument deckt die Entwicklung der Affinitätsaufreinigung (CaptureSMB) und die Polishing-Entwicklung (MCSGP) ab – dies ermöglicht eine vollständig integrierte kontinuierliche zweistufige Reinigungsstrategie.

Der Contichrom TWIN LPLC deckt den klinischen bis kommerziellen Maßstab ab (Säulenvolumina von 100 mL bis 2 L). Die Skalierung vom CUBE zum TWIN LPLC ist linear – Säulenchemie, Gradientenbedingungen und AutoPeak®-Kontrolllogik bleiben erhalten. cGMP-Design, 21 CFR Part 11-Konformität und IQ/OQ/PQ-Dokumentationspakete sind verfügbar.