Point de recherche
De 80 % à 93 % de rendement dans la purification continue de siRNA
Une méthode établie d’échange d’anions sur colonne unique pour un brin sens de siRNA conjugué au sucre a été convertie en un fonctionnement continu à deux colonnes. La pureté s’est maintenue au-dessus de la spécification de 95 %, le rendement a augmenté de 13 points de pourcentage, et un système MCSGP du même diamètre de colonne offrirait 87 % de débit en plus.
Purification continue d’un ARN interférent court thérapeutique conjugué par chromatographie d’échange d’anions à deux colonnes (MCSGP)
Les auteurs déclarent n’avoir aucun intérêt financier concurrent. Richard Weldon et Thomas Müller-Späth travaillent chez YMC ChromaCon ; Tobias Vandermeersch travaille chez Johnson & Johnson, qui a fourni le financement et le matériel d’alimentation pour l’étude.
Citation (BibTeX)
@article{weldon2025continuous,
title = {Purification continue d'un ARN interférent court conjugué
thérapeutique utilisant la chromatographie d'échange d'anions à deux colonnes (MCSGP)},
author = {Weldon, Richard et Vandermeersch, Tobias
et M{\"u}ller-Sp{\"a}th, Thomas},
journal = {Organic Process Research & Development},
volume = {29},
number = {6},
pages = {1400--1410},
year = {2025},
doi = {10.1021/acs.oprd.4c00513}
}
Dans la fabrication d’oligonucléotides, l’étape coûteuse précède la chromatographie. La synthèse en phase solide assemble la séquence un couplage à la fois, et chaque couplage incomplet laisse derrière lui une impureté chimiquement similaire — des oligomères courts et longs que la purification doit ensuite séparer d’une cible à laquelle ils ressemblent étroitement. Le produit perdu à l’étape de polissage doit être remplacé par la synthèse de plus de produit, ce qui représente le coût.
Cela rend le rendement de purification exceptionnellement précieux ici. Une étape de polissage qui récupère davantage de ce qui a été chargé permet de réduire proportionnellement le lot de synthèse, diminuant ainsi les réactifs, les solvants, les déchets et le volume de colonne.
Cette étude convertit une méthode discontinue établie d’échange d’anions sur colonne unique pour un brin sens de siRNA conjugué au sucre en un processus MCSGP continu à deux colonnes. Le rendement passe de 80,0 % à 93,0 % avec une pureté de 95,4 % en surface, par rapport à une spécification de >95 %.
Elle expose également comment la conversion a été effectuée — une procédure assistée par logiciel pour prendre un chromatogramme discontinu et le transformer en une méthode continue en cours d’exécution — et projette ce que le même processus produirait sur un équipement à l’échelle de production.
1. Pourquoi cette étude est importante : le rendement est la variable coûteuse
Les médicaments oligonucléotidiques sont passés de la promesse au produit, avec 15 approbations à ce jour et des centaines de candidats en essais cliniques. Leur fabrication à l’échelle commerciale reste difficile et coûteuse. Au moment de la rédaction, l’échelle GMP commerciale maximale est limitée à une échelle de synthèse de 2 000 mmol utilisant la synthèse d’oligonucléotides en phase solide, et les pertes lors de la purification en aval limitent encore davantage la production maximale par lot.
Ce que coûte le polissage discontinu
L’étape de polissage standard est la chromatographie d’échange d’ions ou en phase inverse sur colonne unique, avec la collecte de la coupe centrale pure du chromatogramme et la mise de côté du reste. Étant donné que la cible ne se sépare pas complètement des impuretés chimiquement similaires, les coupes latérales de pureté inférieure doivent être retraitées ou jetées.
- Fractionnement et regroupement simulé Les rendements en mode discontinu sont maximisés en fractionnant et en analysant le pic d’élution pour trouver les limites optimales de la coupe centrale, puis en générant plusieurs pools de produits simulés pour les tests analytiques et le contrôle qualité. Le document décrit ces tâches comme essentielles pour la libération des lots et une proportion significative de la charge de fabrication globale dans un environnement BPF.
- Rechromatographie des coupes latérales L’alternative courante consiste à regrouper les fractions latérales hors spécification de plusieurs lots et à les réexécuter. Les coupes latérales sont transférées dans des sacs de stockage personnalisés, conservées dans un congélateur dédié, regroupées et diafiltrées pour ajuster la composition du tampon avant le rechargement. Cela améliore le rendement global, mais réduit la productivité du processus.
- La synthèse doit compenser la différence Tout ce que l’étape de polissage perd doit être remplacé en amont. La synthèse d’oligonucléotides est mise à l’échelle pour compenser le produit perdu pendant la purification, ce qui, selon le document, est très coûteux.
Le MCSGP y remédie en recyclant les coupes latérales de faible pureté en interne vers une deuxième colonne, avec une dilution en ligne pour faciliter la réadsorption, de sorte que la rechromatographie devient inutile. La technique a été démontrée sur une gamme de biomolécules ; ce que cette étude ajoute est un cas en mode échange d’anions, sur un siRNA conjugué, tiré d’un processus discontinu existant.
2. L’étude en bref
La molécule est le brin sens d’un siRNA thérapeutique, synthétisé par chimie phosphoramidite standard en phase solide avec la conjugaison du sucre effectuée pendant la synthèse. Le brut est entré en purification à 85 % de pureté en surface, avec l’impureté critique N-1 à 0,93 % en surface, par rapport à une spécification de pureté cible de plus de 95 %.
Rendement du produit, contre 80,0 % pour le processus discontinu à l’échelle pilote
Débit plus élevé qu’un système discontinu du même diamètre de colonne, grâce à l’utilisation de deux colonnes
Pureté du produit en % de surface, par rapport à une spécification de plus de 95 %
Une seule exécution : 13 cycles et 27 élutions de produit, y compris le démarrage et l’arrêt
Ce qui a été exécuté, et sur quoi
La référence discontinue
Une méthode de polissage par échange d’anions à l’échelle pilote sur une colonne de 20 × 5 cm de diamètre intérieur (393 mL) de TOSOH TSKgel SuperQ-5PW, 20 µm, exécutée sur un ÄKTA pure 150 M. Celle-ci a été réduite 78,6 fois à une colonne de 10 × 0,8 cm de diamètre intérieur sur un Contichrom CUBE 30, en maintenant la charge, les volumes de lavage, les débits linéaires et le gradient constants.
Le processus continu
MCSGP sur le même Contichrom CUBE 30 et la même résine, avec des détecteurs UV à chaque sortie de colonne à 280 nm. La méthode a été construite à partir du chromatogramme discontinu réduit à l’aide de MCSGP Wizard v8.1, puis exécutée pendant 13 cycles à une charge de 15,80 g par litre de résine par cycle.
Les deux éluants étaient de même nature : 20 mM de phosphate de sodium avec 10 % en volume d’acétonitrile à pH 8,0, avec du chlorure de sodium fournissant le gradient. La méthode pilote utilisait 0,9 M de NaCl dans la phase mobile B et les exécutions réduites 1,1 M, ce qui a produit un pic plus étroit dans les exécutions réduites — une différence que les auteurs s’attendaient à ce que le recyclage interne compense.
3. Trois façons d’exécuter la même séparation
L’étude rapporte trois processus sur la même chimie : la méthode discontinue pilote, la même méthode réduite, et le MCSGP construit à partir de cette méthode réduite. La comparaison des trois permet de séparer l’effet du mode de fonctionnement de l’effet de la géométrie de la colonne.
- Discontinu, échelle pilote
- Discontinu, réduit
- MCSGP
La référence. Une colonne d’échange d’anions de 20 × 5 cm à l’échelle pilote, avec une coupe centrale collectée pour atteindre l’objectif de pureté de >95 %. Cette coupe récupère 80,0 % du produit — un chiffre que le document décrit comme typique pour la chromatographie préparative discontinue.
- Pureté
- 95,0 % en surface
- Rendement
- 80,0 %
- Productivité
- 5,28 g/Lrésine/h
- Tampon
- 1,25 L/g
Valeurs telles que rapportées dans le tableau 4 de l’étude. Chaque métrique est mise à l’échelle par rapport à la plus grande des trois valeurs, de sorte que les longueurs des barres se comparent au sein d’une ligne et non entre les lignes. Les couleurs suivent les propres figures du document : noir et bleu pour les tracés discontinus pilote et réduits de la figure 3A, rouge pour la fenêtre de collecte du produit MCSGP de la figure 4B. La pureté pour le lot discontinu réduit a été déterminée par HPLC-UV uniquement, et non par HPLC-UV/MS comme pour les deux autres.
4. De la méthode discontinue au processus continu
Le MCSGP est plus complexe à mettre en place que la chromatographie sur colonne unique, et le document note qu’il nécessite des outils de développement de processus spécialisés pour l’optimiser et le mettre en œuvre. Sa contribution pratique est une procédure qui part de quelque chose qu’un chimiste de processus possède déjà — un chromatogramme discontinu fractionné avec des données de pureté — et le transforme en une méthode à deux colonnes en cours d’exécution.
- Exécuter une méthode de conception discontinue L’exécution discontinue réduite a été répétée à un débit d’élution élevé de 200 cm/h pour maximiser les performances du MCSGP, l’éluat a été fractionné et chaque fraction analysée par HPLC. Le chromatogramme a ensuite été superposé aux puretés de fraction mesurées.
- Définir les limites de phase à l’écran Ce chromatogramme et ses données de pureté ont été téléchargés dans MCSGP Wizard v8.1. Les limites entre les phases de recyclage et de collecte ont été définies par glisser-déposer par rapport au profil de pureté, afin d’optimiser la pureté de la fenêtre de collecte du produit.
- Laisser le logiciel dimensionner le reste Les paramètres de gradient, la charge par commutation et les facteurs de dilution en ligne ont été calculés automatiquement à partir du chromatogramme importé et de la position relative des limites de phase. Les étapes de lavage, de nettoyage et de régénération ont été saisies dans un tableau modèle.
- Exécuter les méthodes générées L’assistant a produit un ensemble de méthodes de démarrage, principales et d’arrêt prêtes à être exécutées sur le matériel Contichrom CUBE.
Ce que font les quatre phases
Chaque commutation MCSGP comporte quatre phases, et les deux qui définissent la technique sont les étapes de recyclage. Dans la phase 1, un gradient démarre sur la première colonne tandis que la seconde est nettoyée et régénérée en parallèle. Dans la phase 2, les colonnes sont interconnectées et la coupe latérale de faible pureté à élution précoce est transférée de la colonne amont vers la colonne aval, avec une dilution en ligne réduisant la teneur en modificateur afin que le produit se réadsorbe. Dans la phase 3, les colonnes fonctionnent à nouveau en parallèle : le produit pur est collecté de la première tandis que la seconde reçoit une nouvelle alimentation brute. Dans la phase 4, la coupe latérale de faible pureté à élution tardive est recyclée de la même manière qu’en phase 2. Les colonnes échangent ensuite leurs positions et la séquence se répète.
Une analogie simple
Un ébéniste achète plus de bois que ce dont la pièce finie a besoin, car une partie de chaque planche est perdue à cause des coupes et des défauts. Réduire les chutes ne se voit pas dans l’atelier — cela se voit sur la facture de bois.
Le rendement de purification fonctionne de la même manière ici. L’étape de polissage est la coupe ; la synthèse d’oligonucléotides est le bois, et le bois est la partie coûteuse. Récupérer 93 % du produit chargé au lieu de 80 % signifie qu’un lot de synthèse plus petit fournit la même quantité de matériau fini, réduisant ainsi les réactifs, les solvants et les déchets.
5. Ce qu’a montré l’exécution de 13 cycles
Une exécution MCSGP de 13 cycles a été réalisée, donnant 27 élutions de produit, y compris le démarrage et l’arrêt, sur une durée totale de 17 heures. Le nombre de cycles n’était limité que par la quantité de brut disponible pour l’étude.
Convergence
Un processus continu doit se stabiliser avant de pouvoir être jugé, et l’étude suit cette stabilisation de trois manières. La surface sous la courbe UV pour la phase de collecte du produit a atteint une valeur constante au cycle 5, indiquant que la masse de produit entrant et sortant du système était en état stationnaire. La pureté du produit a suivi le même schéma : elle commence à 95,6 % en surface, diminue et se stabilise autour de 95,1 % en surface. L’impureté critique N-1 commence à 0,5 % en surface, augmente et se stabilise autour de 0,7 % en surface — à l’intérieur de la spécification de moins de 1,0 %.
Le rendement par cycle était stable à environ 94-95 %, avec une récupération de produit se maintenant entre 127 et 130 mg par cycle. L’étape d’arrêt a donné un rendement beaucoup plus faible de 62 %, ce qui est une caractéristique normale du MCSGP : il est calculé par rapport à la charge plus importante appliquée au démarrage, et son effet sur le chiffre global diminue à mesure que le nombre de cycles augmente. En incluant le démarrage et l’arrêt, le rendement global était de 93 %.
Accumulation d’impuretés, observée plutôt que supposée
Une certaine accumulation était détectable dans la région subissant le recyclage des impuretés fortement adsorbantes. Le document considère cela comme attendu plutôt qu’alarmant : l’accumulation d’impuretés dans les régions de recyclage est typique du MCSGP, et ne devient un problème que si elle s’étend au pool de produit et entraîne le non-respect de la spécification. Ce ne fut pas le cas ici, et le remède indiqué, si cela s’était produit, aurait été de réduire les fenêtres de recyclage pendant la conception du processus et d’envoyer plus d’impuretés aux déchets.
Les tracés de conductivité se sont superposés de manière reproductible sur toute l’exécution, indiquant une performance stable du système, et les auteurs notent que la surveillance de la surface sous la courbe cycle par cycle donne à un opérateur un signal en direct : une déviation par rapport aux limites prédéfinies peut déclencher un ajustement, une pause ou un arrêt de l’exécution avant que du temps et du matériel ne soient gaspillés.
6. Résultats complets et mise à l’échelle
Faites glisser le tableau latéralement pour voir les trois processus.
| Métrique | Discontinu, pilote | Discontinu, réduit | MCSGP |
|---|---|---|---|
| Brin sens de siRNA alimentation 85,0 % en surface · spécification >95 % | |||
| Pureté du produit (% en surface) | 95,0 | 95,79 * | 95,44 |
| Impureté N-1 (% en surface) | 1,0 | 0,82 * | 0,74 |
| Rendement du produit (%) | 80,0 | 77,32 | 93,02 |
| Productivité (g/Lrésine/h) | 5,28 | 10,09 | 9,88 |
| Consommation de tampon (L/g) | 1,25 | 1,29 | 1,86 |
| Concentration du produit (g/L) | 2,5 | 2,91 | 2,80 |
Source : Tableau 4, Weldon, Vandermeersch et Müller-Späth, Org. Process Res. Dev. 2025, 29, 1400–1410 (CC BY). * Le lot discontinu réduit a été évalué par HPLC-UV uniquement, et non par spectrométrie de masse, de sorte que ces deux valeurs ne sont pas strictement comparables aux autres.
Lecture attentive du chiffre de productivité
La productivité par litre de résine était de 9,88 g/Lrésine/h pour le MCSGP contre 10,09 pour le lot discontinu réduit — pratiquement la même. Le gain par rapport au processus discontinu pilote, à 5,28, provient de la hauteur du lit : la colonne réduite est deux fois moins haute, de sorte que le temps de résidence pendant l’élution a été divisé par deux et la productivité a approximativement doublé. En pratique, la moitié de la hauteur du lit avec deux fois la productivité donne un débit global similaire, puisque le débit est la productivité multipliée par le volume de la colonne.
L’avantage de 87 % en termes de débit rapporté par le document est une comparaison différente : un système MCSGP utilise deux colonnes au lieu d’une, avec le même diamètre de colonne. Autrement dit, une élution en MCSGP s’est achevée en 38 minutes contre 90 minutes pour une élution discontinue de la même colonne de 10 cm. Trois facteurs y contribuent : le rendement plus élevé, le débit d’élution plus élevé utilisé en MCSGP (200 contre 150 cm/h, ce qui comporte moins de risques car le recyclage garantit le rendement), et le fait que la régénération, le nettoyage et l’alimentation se déroulent en parallèle avec l’élution sur l’autre colonne.
Scénarios de mise à l’échelle
Les processus MCSGP développés sur le Contichrom CUBE sont directement évolutifs vers le Contichrom TWIN, un système de production capable de fonctionner sous BPF. L’étude projette quatre configurations.
Faites glisser le tableau latéralement pour voir les quatre configurations.
| Paramètre | Twin 300 | Twin 500 | Twin 1000 | Twin 2000 |
|---|---|---|---|---|
| Diamètre intérieur de la colonne (cm) | 20 | 30 | 45 | 60 |
| Volume de la colonne (L) | 2 × 3,0 | 2 × 7,0 | 2 × 15,8 | 2 × 27,5 |
| Entrée, 85 % en surface (kg/jour) | 1,80 | 4,20 | 9,50 | 16,50 |
| Sortie, 95,4 % en surface (kg/jour) | 1,42 | 3,32 | 7,51 | 13,05 |
| Consommation de tampon (L/jour) | 2 647 | 6 177 | 13 970 | 24 265 |
Source : Tableau 5 de l’étude. Il s’agit de scénarios de mise à l’échelle calculés plutôt que d’exécutions démontrées. Le document indique que la plus grande configuration, en supposant 24 heures de fonctionnement continu, permet une production à l’échelle de plusieurs tonnes par an.
7. Ce que cela signifie pour la fabrication d’oligonucléotides
Le chiffre principal est un gain de 13 points de pourcentage en rendement, mais l’argument avancé par le document concerne ce que ce gain apporte en amont. Un rendement chromatographique plus élevé permet de réduire proportionnellement le lot de synthèse chimique pour la même production de produit.
C’est important car la synthèse est l’endroit où se trouvent le coût des matières premières, les intermédiaires personnalisés et la charge de solvant. Les auteurs rapportent que pour une production équivalente, le MCSGP entraîne un coût des marchandises inférieur de 14 %, et ils attribuent cette économie à moins de matières premières et de consommables, moins d’intermédiaires oligonucléotidiques personnalisés, des lots de synthèse plus petits et des volumes de résine de chromatographie plus petits. En ce qui concerne spécifiquement la résine, ils calculent qu’un système discontinu sur colonne unique à l’échelle de production nécessite 86 % de résine en plus que le MCSGP pour une production équivalente — et notent que ce chiffre pourrait sous-estimer la différence, car la chromatographie discontinue n’est généralement pas exécutée en continu.
Outre les améliorations de processus mesurées, le document présente une série d’avantages opérationnels attendus de l’automatisation : moins d’échantillons de contrôle en cours de processus et donc une charge analytique BPF réduite, l’élimination de la rechromatographie avec ses sacs de stockage, son espace de congélation et sa diafiltration, moins d’interaction de l’opérateur et moins de risques d’erreur de l’utilisateur, et des colonnes plus petites plus faciles à garnir. Ces points sont argumentés plutôt que mesurés dans cette étude.
Une note méthodologique à retenir : la méthode d’échange d’anions ici a atteint plus de 95 % de pureté en modes discontinu et MCSGP, alors que les auteurs affirment que les méthodes AIEX à base de NaOH, selon leur expérience, donnent généralement 88-92 %. Ils suggèrent que la phase mobile tamponnée au phosphate avec 10 % d’acétonitrile a pu améliorer la sélectivité en réduisant les interactions hydrophobes indésirables, mais notent également que le brut est entré avec une pureté de départ élevée de 85 %.
La même conversion a été réalisée en mode phase inverse sur un gapmère conjugué au GalNAc, rapportée dans une étude complémentaire de cette série. Pour la vue d’ensemble de la plateforme indiquant où le MCSGP s’intègre dans un flux de travail oligonucléotidique, voir purification d’oligonucléotides avec MCSGP.
Ce que l’étude ne prétend pas
- AutoPeak n’a pas été évalué. La méthode MCSGP utilisée ici était entièrement basée sur le temps. Le contrôle de processus dynamique basé sur l’UV a été omis en raison de la quantité limitée de matière brute — et le document indique qu’à l’échelle BPF, AutoPeak est essentiel pour compenser les différences de temps de rétention causées par la variabilité du garnissage de la colonne, de la préparation du tampon ou de la cohérence de l’alimentation.
- La consommation de tampon était plus élevée, pas plus faible. 1,86 L/g pour le MCSGP contre 1,25 L/g pour le lot pilote. L’optimisation était hors du champ de l’étude par manque de matière brute. Les auteurs identifient trois voies qu’ils s’attendraient à voir la réduire : un facteur de dilution en ligne moins conservateur, la suppression du lavage optionnel après un recyclage fort, et l’augmentation de la charge.
- La productivité par litre de résine a été égalée, pas améliorée. 9,88 contre 10,09 g/Lrésine/h pour le lot discontinu réduit. L’avantage en termes de débit provient de l’utilisation de deux colonnes et de la planification parallèle — et non d’une séparation plus productive.
- Le tableau de mise à l’échelle est une projection. Les quatre configurations Twin sont des scénarios calculés, et non des exécutions de production démontrées.
- Une molécule, 13 cycles, alimentation limitée. Le nombre de cycles a été déterminé par la disponibilité du brut plutôt que par la stabilité du processus, et l’optimisation de la charge n’a pas été tentée pour le MCSGP.
- Deux valeurs de pureté ne sont pas strictement comparables. Le lot discontinu réduit a été évalué par HPLC-UV seule ; les chiffres du lot pilote et du MCSGP sont HPLC-UV/MS.
- Affiliations et financement. Les auteurs déclarent n’avoir aucun intérêt financier concurrent. Deux sont employés par YMC ChromaCon, qui commercialise le MCSGP ; le troisième travaille chez Johnson & Johnson, qui a financé l’étude et fourni le matériel d’alimentation.
8. Termes clés de cette étude (Glossaire)
| Terme | Définition |
|---|---|
| AIEX | Chromatographie d’échange d’anions, qui sépare les molécules par charge négative. Bien adaptée aux oligonucléotides, dont le squelette phosphate porte une charge proportionnelle à la longueur de la séquence. |
| % en surface | Pureté exprimée en pourcentage de la surface totale du pic attribuable au produit dans un tracé HPLC analytique. |
| AutoPeak | Contrôle de processus dynamique basé sur l’UV pour le MCSGP, qui compense les décalages du temps de rétention des pics causés par la variation de la préparation de l’éluant, du garnissage de la colonne ou de la qualité de l’alimentation. Non utilisé dans cette étude. |
| Coupe centrale | La portion centrale pure d’un pic d’élution discontinu, collectée comme produit. Ses limites sont trouvées en fractionnant et en analysant le pic. |
| Cycle et commutation | Une commutation est une élution d’une colonne, comprenant quatre phases. Un cycle est deux commutations — une élution de chacune des deux colonnes. |
| État stationnaire cyclique | La condition dans un processus continu où chaque cycle reproduit le précédent. Atteint ici au cycle 5. |
| Dilution en ligne | Dilution du flux recyclé entre des colonnes interconnectées, abaissant sa teneur en modificateur afin que le produit se réadsorbe sur la colonne aval au lieu de la traverser. |
| MCSGP | Purification par gradient de solvant à contre-courant multicolonne : un processus de chromatographie continue à deux colonnes qui recycle les coupes latérales de faible pureté en interne plutôt que de les jeter. |
| Impureté N-1 | Un oligomère court d’un nucléotide de moins que la cible, produit par un couplage incomplet pendant la synthèse. L’impureté critique suivie dans cette étude, avec une spécification de moins de 1,0 % en surface. |
| Médicament oligonucléotidique (OND) | Un thérapeutique construit à partir d’une courte séquence nucléotidique, capable de moduler l’expression génique avec une grande spécificité. |
| Productivité | Masse de produit par litre de résine par heure. Elle dépend de la hauteur du lit ainsi que de la séparation, elle doit donc être comparée entre des colonnes de géométrie similaire. |
| Rechromatographie | Regroupement des fractions latérales hors spécification de plusieurs lots et leur réexécution pour récupérer le produit. Améliore le rendement mais réduit la productivité globale, et est éliminée par le MCSGP. |
| Brin sens | L’un des deux brins d’un siRNA double brin. Le brin purifié dans cette étude portait une conjugaison de sucre ajoutée pendant la synthèse. |
| Coupe latérale | La fraction de pureté inférieure de chaque côté de la coupe centrale, où le produit chevauche des impuretés étroitement liées. |
| SPOS | Synthèse d’oligonucléotides en phase solide, la voie standard pour la fabrication d’oligonucléotides à grande échelle. |
| Débit | Productivité multipliée par le volume de la colonne. C’est le chiffre qui détermine la quantité produite par un système par unité de temps, par opposition à l’intensité du travail de la résine. |
| Recyclage faible et fort | Retour de la coupe latérale à élution précoce (faible, phase 2) et de la coupe latérale à élution tardive (forte, phase 4) vers la colonne aval. |
9. Foire aux questions
Oui. Cette étude a converti une méthode discontinue d’échange d’anions sur colonne unique établie pour un brin sens de siRNA conjugué au sucre en un processus MCSGP continu à deux colonnes, exécutant 13 cycles et 27 élutions de produit sur 17 heures. Le rendement est passé de 80,0 % à 93,02 % tandis que la pureté s’est maintenue à 95,44 % en surface, par rapport à une spécification de plus de 95 %.
Les deux. Cette étude de cas démontre la technique en mode échange d’anions. Le document note que le MCSGP utilise les mêmes phases stationnaires et combinaisons d’éluants que le polissage sur colonne unique — échange d’ions, phase inverse ou interaction hydrophobe — et fonctionne pour les purifications isocratiques ou à gradient linéaire, à condition que la cible s’adsorbe complètement sur la phase stationnaire et se désorbe une fois la concentration du modificateur augmentée.
Dans ce cas, 13 points de pourcentage : 93,02 % pour le MCSGP contre 80,0 % pour le processus discontinu à l’échelle pilote, à pureté pratiquement inchangée. Le document note que cela est conforme aux études MCSGP précédentes sur les oligonucléotides, où des rendements supérieurs à 90 % étaient constamment réalisables.
Pas par litre de résine, dans cette étude. La productivité était de 9,88 g/Lrésine/h pour le MCSGP contre 10,09 pour la méthode discontinue réduite sur la même colonne — pratiquement identique. L’avantage est au niveau du système : un système MCSGP utilise deux colonnes au lieu d’une, de sorte que le débit global serait 87 % plus élevé qu’un système discontinu du même diamètre de colonne. Une élution MCSGP a pris 38 minutes contre 90 minutes pour une élution discontinue de la même colonne, aidée par le rendement plus élevé, un débit d’élution plus élevé et l’exécution de la régénération et de l’alimentation en parallèle avec l’élution sur l’autre colonne.
Plus, dans cette étude : 1,86 L par gramme de produit contre 1,25 L/g pour le processus discontinu pilote. Les auteurs attribuent cela principalement à la dilution en ligne que le recyclage MCSGP nécessite, et notent que le facteur de dilution a été réglé de manière conservatrice à un niveau élevé pour assurer la rebinding du produit recyclé à la colonne. Ils n’ont pas optimisé la consommation de tampon ici car la matière brute était limitée, et identifient un facteur de dilution plus faible, la suppression du lavage optionnel après un recyclage fort, et l’augmentation de la charge comme des voies pour la réduire.
L’élution discontinue est fractionnée et chaque fraction est analysée pour sa pureté, puis le chromatogramme et ses données de pureté sont téléchargés dans le logiciel MCSGP Wizard. Les limites entre les phases de recyclage et de collecte sont définies par glisser-déposer par rapport au profil de pureté, et le logiciel calcule automatiquement les paramètres de gradient, la charge par commutation et les facteurs de dilution en ligne, générant des méthodes de démarrage, principales et d’arrêt prêtes à être exécutées.
L’étude projette quatre configurations Contichrom TWIN, de 20 cm à 60 cm de diamètre intérieur de colonne, produisant entre environ 1,4 et 13 kg de brin sens de siRNA purifié par jour. Il s’agit de scénarios de mise à l’échelle calculés plutôt que d’exécutions démontrées ; le document indique que la plus grande configuration, à 24 heures de fonctionnement continu, permet une production à l’échelle de plusieurs tonnes par an.
Oui. Il est publié en accès libre sous licence CC BY 4.0 dans Organic Process Research & Development, il peut donc être lu, téléchargé et réutilisé avec citation. Des informations complémentaires couvrant le gradient HPLC analytique et les paramètres spécifiques de démarrage et de méthode principale du MCSGP sont disponibles gratuitement avec l’article.
