Kontinuierliche Anionenaustausch-Aufreinigung einer konjugierten siRNA

Kontinuierliche Aufreinigung eines konjugierten therapeutischen Short Interfering RNA mittels Anionenaustausch-Doppelspalten-Chromatographie (MCSGP)

Richard Weldon, Tobias Vandermeersch und Thomas Müller-Späth

Organic Process Research & Development 2025, 29(6), 1400–1410 · Veröffentlicht am 2. Juni 2025
DOI: 10.1021/acs.oprd.4c00513 · Open Access, CC BY 4.0

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Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen. Richard Weldon und Thomas Müller-Späth sind bei YMC ChromaCon tätig; Tobias Vandermeersch ist bei Johnson & Johnson beschäftigt, das die Finanzierung und das Ausgangsmaterial für die Studie bereitstellte.

Zitation (BibTeX)

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  Therapeutic Using Anion Exchange Twin-Column Chromatography (MCSGP)},
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  und Müller-Späth, Thomas},
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In der Oligonukleotid-Herstellung erfolgt der teure Schritt vor der Chromatographie. Die Festphasensynthese baut die Sequenz Kopplung für Kopplung auf, und jede unvollständige Kopplung hinterlässt eine chemisch ähnliche Verunreinigung – Shortmer und Longmer, die bei der Aufreinigung von einem Zielmolekül getrennt werden müssen, dem sie stark ähneln. Produktverluste im Polishing-Schritt müssen durch zusätzliche Synthese ausgeglichen werden, was die Kosten verursacht.

Das macht die Ausbeute bei der Aufreinigung hier besonders wertvoll. Ein Polishing-Schritt, der mehr vom geladenen Material zurückgewinnt, ermöglicht eine proportionale Verkleinerung des Synthese-Batches, wodurch Reagenzien, Lösungsmittel, Abfall und Säulenvolumen reduziert werden.

Sie beschreibt zudem, wie die Umstellung erfolgte – ein softwaregestütztes Verfahren, um ein Batch-Chromatogramm in eine laufende kontinuierliche Methode zu überführen – und prognostiziert, was derselbe Prozess auf Produktionsanlagen liefern würde.

1. Warum diese Studie wichtig ist: Die Ausbeute ist die teure Variable

Oligonukleotid-Medikamente haben sich vom Versprechen zum Produkt entwickelt, mit bisher 15 Zulassungen und Hunderten von Kandidaten in klinischen Studien. Die Herstellung im kommerziellen Maßstab bleibt anspruchsvoll und teuer. Zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Berichts ist der maximale kommerzielle GMP-Maßstab auf einen Synthesemaßstab von 2.000 mmol mittels Festphasen-Oligonukleotidsynthese begrenzt, und Verluste während der Downstream-Aufreinigung schränken den maximalen Ausstoß pro Batch weiter ein.

Was Batch-Polishing kostet

Der Standard-Polishing-Schritt ist die Einzelsäulen-Ionenaustausch- oder RP-Chromatographie, wobei der reine Mittelschnitt des Chromatogramms gesammelt und der Rest beiseitegelegt wird. Da sich das Zielmolekül nicht vollständig von chemisch ähnlichen Verunreinigungen trennen lässt, müssen die weniger reinen Seitenschnitte entweder erneut verarbeitet oder verworfen werden.

• Fraktionierung und Mock-Pooling Die Ausbeuten im Batch-Modus werden maximiert, indem der Elutionspeak fraktioniert und analysiert wird, um die optimalen Grenzen für den Mittelschnitt zu finden, und anschließend mehrere Mock-Produktpools für analytische Tests und die Qualitätskontrolle erstellt werden. Das Paper beschreibt diese Aufgaben als essenziell für die Chargenfreigabe und als erheblichen Teil des gesamten Herstellungsaufwands in einer GMP-Umgebung.
• Rechromatographie von Seitenschnitten Die gängige Alternative besteht darin, die außerhalb der Spezifikation liegenden Seitenfraktionen aus mehreren Chargen zu poolen und erneut laufen zu lassen. Die Seitenschnitte werden in spezielle Lagerbeutel überführt, in einem begehbaren Gefrierschrank aufbewahrt, gepoolt und diafiltriert, um die Pufferzusammensetzung vor dem erneuten Laden anzupassen. Dies verbessert die Gesamtausbeute, verringert jedoch die Produktivität des Prozesses.
• Die Synthese muss die Differenz ausgleichen Was im Polishing-Schritt verloren geht, muss upstream ersetzt werden. Die Oligonukleotidsynthese wird hochskaliert, um die während der Aufreinigung verlorenen Produktmengen zu kompensieren, was laut Paper sehr kostspielig ist.

MCSGP adressiert dies, indem die Seitenschnitte mit geringer Reinheit intern auf eine zweite Säule rezirkuliert werden, wobei eine In-line-Verdünnung die Readsorption unterstützt, sodass eine Rechromatographie unnötig wird. Die Technik wurde bereits für eine Reihe von Biomolekülen demonstriert; diese Studie ergänzt einen Fall im Anionenaustausch-Modus an einer konjugierten siRNA, ausgehend von einem bestehenden Batch-Prozess.

2. Die Studie auf einen Blick

Das Molekül ist der Sense-Strang einer therapeutischen siRNA, synthetisiert durch Standard-Phosphoramidit-Chemie an der Festphase, wobei die Zuckerkonjugation während der Synthese erfolgte. Das Rohmaterial ging mit einer Produktreinheit von 85 Flächen-% in die Aufreinigung, wobei die kritische N-1-Shortmer-Verunreinigung bei 0,93 Flächen-% lag, bei einer Zielreinheitsspezifikation von mehr als 95 %.

Was gefahren wurde und worauf

Beide Eluenten waren von der gleichen Art: 20 mM Natriumphosphat mit 10 Vol.-% Acetonitril bei pH 8,0, wobei Natriumchlorid den Gradienten lieferte. Die Pilotmethode verwendete 0,9 M NaCl in der mobilen Phase B und die Downscale-Läufe 1,1 M, was in den Downscale-Läufen zu einem schmaleren Peak führte – ein Unterschied, von dem die Autoren erwarteten, dass die interne Rezirkulierung ihn kompensieren würde.

3. Drei Wege, dieselbe Trennung durchzuführen

Die Studie berichtet über drei Prozesse mit derselben Chemie: die Pilot-Batch-Methode, dieselbe Methode downgescaled und MCSGP, basierend auf dieser downgescaleten Methode. Der Vergleich aller drei trennt den Effekt des Betriebsmodus vom Effekt der Säulengeometrie.

4. Von der Batch-Methode zum kontinuierlichen Prozess

MCSGP ist komplexer einzurichten als die Einzelsäulen-Chromatographie, und das Paper stellt fest, dass spezialisierte Prozessentwicklungstools zur Optimierung und Implementierung erforderlich sind. Sein praktischer Beitrag ist ein Verfahren, das bei etwas ansetzt, das ein Prozesschemiker bereits hat – einem fraktionierten Batch-Chromatogramm mit Reinheitsdaten – und dieses in eine laufende Doppelspalten-Methode überführt.

• Durchführung einer Batch-Design-Methode Der downgescalete Batch-Lauf wurde mit einer erhöhten Elutionsflussrate von 200 cm/h wiederholt, um die MCSGP-Leistung zu maximieren, das Eluat fraktioniert und jede Fraktion mittels HPLC analysiert. Das Chromatogramm wurde dann mit den gemessenen Fraktionsreinheiten überlagert.
• Festlegen der Phasengrenzen am Bildschirm Dieses Chromatogramm und seine Reinheitsdaten wurden in den MCSGP Wizard v8.1 hochgeladen. Die Grenzen zwischen den Rezirkulierungs- und Sammelphasen wurden per Drag-and-Drop gegen das Reinheitsprofil festgelegt, um die Reinheit des Produktsammelfensters zu optimieren.
• Softwaregestützte Dimensionierung des Rests Gradientenparameter, die Beladung pro Switch und die In-line-Verdünnungsfaktoren wurden automatisch aus dem importierten Chromatogramm und der relativen Position der Phasengrenzen berechnet. Wasch-, Reinigungs- und Regenerationsschritte wurden in eine Vorlagentabelle eingegeben.
• Ausführen der generierten Methoden Der Wizard erstellte einen Satz von Start-, Haupt- und Shutdown-Methoden, die auf der Contichrom CUBE-Hardware ausgeführt werden konnten.

Was die vier Phasen bewirken

Jeder MCSGP-Switch hat vier Phasen, und die beiden, die die Technik definieren, sind die Rezirkulierungsschritte. In Phase 1 startet ein Gradient auf der ersten Säule, während die zweite parallel gereinigt und regeneriert wird. In Phase 2 werden die Säulen miteinander verbunden und der früh eluierende Seitenschnitt mit geringer Reinheit wird von der vorgeschalteten Säule auf die nachgeschaltete übertragen, wobei eine In-line-Verdünnung den Modifikatorgehalt senkt, damit das Produkt readsorbiert. In Phase 3 laufen die Säulen wieder parallel: Reines Produkt wird von der ersten gesammelt, während die zweite frisches Rohmaterial erhält. In Phase 4 wird der spät eluierende Seitenschnitt mit geringer Reinheit auf die gleiche Weise wie in Phase 2 rezirkuliert. Die Säulen tauschen dann die Positionen und die Sequenz wiederholt sich.

5. Was der 13-Zyklen-Lauf zeigte

Es wurde ein MCSGP-Lauf über 13 Zyklen durchgeführt, der 27 Produktelutionen einschließlich Start und Herunterfahren über eine Gesamtlaufzeit von 17 Stunden ergab. Die Zykluszahl war nur durch die Menge an verfügbarem Rohmaterial für die Studie begrenzt.

Konvergenz

Ein kontinuierlicher Prozess muss sich einpendeln, bevor er beurteilt werden kann, und die Studie verfolgt dieses Einpendeln auf drei Wegen. Die Fläche unter der UV-Kurve für die Produktsammelphase erreichte bis Zyklus 5 einen konstanten Wert, was darauf hindeutet, dass sich die Masse des in das System eintretenden und es verlassenden Produkts im Fließgleichgewicht befand. Die Produktreinheit folgte demselben Muster: Sie beginnt bei 95,6 Flächen-%, sinkt und stabilisiert sich bei etwa 95,1 Flächen-%. Die kritische N-1-Verunreinigung beginnt bei 0,5 Flächen-%, steigt und stabilisiert sich bei etwa 0,7 Flächen-% – innerhalb der Spezifikation von weniger als 1,0 %.

Die Ausbeute pro Zyklus war mit etwa 94–95 % stabil, wobei die Produktrückgewinnung zwischen 127 und 130 mg pro Zyklus lag. Der Shutdown-Schritt lieferte mit 62 % einen deutlich niedrigeren Wert, was ein normales Merkmal von MCSGP ist: Er wird gegen die größere Beladung während des Starts berechnet, und sein Effekt auf den Gesamtwert schrumpft mit steigender Zyklenzahl. Einschließlich Start und Herunterfahren betrug die Gesamtausbeute 93 %.

Verunreinigungsakkumulation, beobachtet statt angenommen

In dem Bereich, in dem stark adsorbierende Verunreinigungen rezirkuliert wurden, war eine gewisse Akkumulation feststellbar. Das Paper behandelt dies eher als erwartet denn als alarmierend: Eine Akkumulation von Verunreinigungen in den Rezirkulierungsbereichen ist bei MCSGP typisch und wird erst dann zum Problem, wenn sie sich in den Produktpool erstreckt und dazu führt, dass die Spezifikation verfehlt wird. Dies war hier nicht der Fall, und die angegebene Abhilfe, falls es dazu gekommen wäre, bestünde darin, die Rezirkulierungsfenster während des Prozessdesigns zu verengen und mehr Verunreinigungen in den Abfall zu leiten.

Die Leitfähigkeitsspuren überlagerten sich über den gesamten Lauf reproduzierbar, was auf eine stabile Systemleistung hindeutet. Die Autoren stellen fest, dass die Überwachung der Fläche unter der Kurve von Zyklus zu Zyklus dem Bediener ein Live-Signal gibt: Abweichungen von vordefinierten Grenzwerten können dazu führen, dass ein Lauf angepasst, pausiert oder abgebrochen wird, bevor Zeit und Material verschwendet werden.

6. Vollständige Ergebnisse und Scale-up

Wischen Sie die Tabelle zur Seite, um alle drei Prozesse zu sehen.

Quelle: Tabelle 4, Weldon, Vandermeersch und Müller-Späth, Org. Process Res. Dev. 2025, 29, 1400–1410 (CC BY). * Der downgescalete Batch wurde nur mittels HPLC-UV bewertet, nicht mittels Massenspektrometrie, daher sind diese beiden Werte nicht strikt mit den anderen vergleichbar.

Die Produktivitätszahl genau lesen

Die Produktivität pro Liter Harz betrug 9,88 g/L_Harz/h für MCSGP gegenüber 10,09 für den downgescaleten Batch – faktisch gleich. Der Gewinn gegenüber dem Pilot-Batch-Prozess mit 5,28 resultiert aus der Betthöhe: Die downgescalete Säule ist halb so hoch, wodurch sich die Verweilzeit während der Elution halbierte und die Produktivität in etwa verdoppelte. In der Praxis ergibt die halbe Betthöhe bei doppelter Produktivität einen ähnlichen Gesamtdurchsatz, da der Durchsatz das Produkt aus Produktivität und Säulenvolumen ist.

Der im Paper berichtete Durchsatzvorteil von 87 % ist ein anderer Vergleich: Ein MCSGP-System betreibt zwei Säulen statt einer bei gleichem Säulendurchmesser. Anders ausgedrückt: Eine Elution im MCSGP war in 38 Minuten abgeschlossen, gegenüber 90 Minuten für eine Batch-Elution an derselben 10-cm-Säule. Drei Faktoren tragen dazu bei: die höhere Ausbeute, die höhere Elutionsflussrate bei MCSGP (200 gegenüber 150 cm/h, was weniger Risiko birgt, da die Rezirkulierung die Ausbeute sichert) und die Tatsache, dass Regeneration, Reinigung und Beladung parallel zur Elution auf der anderen Säule laufen.

Scale-up-Szenarien

Auf dem Contichrom CUBE entwickelte MCSGP-Prozesse sind direkt auf den Contichrom TWIN skalierbar, ein Produktionssystem, das unter GMP-Bedingungen betrieben werden kann. Die Studie projiziert vier Konfigurationen.

Wischen Sie die Tabelle zur Seite, um alle vier Konfigurationen zu sehen.

Quelle: Tabelle 5 der Studie. Dies sind berechnete Scale-up-Szenarien und keine demonstrierten Läufe. Das Paper stellt fest, dass die größte Konfiguration bei 24 Stunden kontinuierlichem Betrieb eine Produktion im Multitonnen-Maßstab pro Jahr ermöglicht.

7. Was dies für die Oligonukleotid-Herstellung bedeutet

Die Schlagzeile ist ein Gewinn von 13 Prozentpunkten bei der Ausbeute, aber das Argument des Papers bezieht sich darauf, was dieser Gewinn upstream bewirkt. Eine höhere chromatographische Ausbeute ermöglicht es, den chemischen Synthese-Batch bei gleichem Produktausstoß proportional zu verkleinern.

Das ist wichtig, da in der Synthese die Rohstoffkosten, die kundenspezifischen Intermediate und die Lösungsmittelbelastung anfallen. Die Autoren berichten, dass MCSGP bei gleichem Produktausstoß 14 % niedrigere Herstellkosten verursacht, und führen die Einsparung auf weniger Rohstoffe und Verbrauchsmaterialien, weniger kundenspezifische Oligonukleotid-Intermediate, kleinere Synthese-Batches und geringere Mengen an Chromatographieharz zurück. Speziell beim Harz berechnen sie, dass ein Einzelsäulen-Batch-System im Produktionsmaßstab 86 % mehr Harz benötigt als MCSGP für den gleichen Ausstoß – und stellen fest, dass diese Zahl den Unterschied möglicherweise noch unterschätzt, da die Batch-Chromatographie normalerweise nicht kontinuierlich betrieben wird.

Neben den gemessenen Prozessverbesserungen führt das Paper eine Reihe von betrieblichen Vorteilen auf, die es durch Automatisierung erwartet: weniger In-Prozess-Kontrollproben und damit ein geringerer GMP-Analytikaufwand, der Wegfall der Rechromatographie mit ihren Lagerbeuteln, Gefrierkapazitäten und der Diafiltration, weniger Interaktion durch das Bedienpersonal und weniger Spielraum für Anwenderfehler sowie kleinere Säulen, die einfacher zu packen sind. Diese Punkte werden in dieser Studie eher argumentativ dargelegt als gemessen.

Eine methodische Anmerkung, die man im Hinterkopf behalten sollte: Die Anionenaustauschmethode erreichte hier sowohl im Batch- als auch im MCSGP-Modus eine Reinheit von über 95 %, während NaOH-basierte AIEX-Methoden nach Erfahrung der Autoren normalerweise 88–92 % liefern. Sie vermuten, dass die phosphatgepufferte mobile Phase mit 10 % Acetonitril die Selektivität durch Reduzierung unerwünschter hydrophober Wechselwirkungen verbessert haben könnte, stellen aber auch fest, dass das Rohmaterial bereits mit einer hohen Ausgangsreinheit von 85 % eintrat.

8. Schlüsselbegriffe in dieser Studie (Glossar)

9. Häufig gestellte Fragen