Point de recherche
Briser le compromis rendement-pureté pour les oligonucléotides GalNAc
Une purification par lots en phase inverse d’un gapmer conjugué à un cluster GalNAc a permis de récupérer un peu plus de la moitié du produit conforme aux spécifications. Réalisée en tant que processus continu à deux colonnes avec la même chimie, elle a récupéré 91,6 % — suffisamment pour réduire l’étape de synthèse des oligonucléotides de 42,5 % pour la même production quotidienne.
Purification d’un oligonucléotide conjugué à un cluster GalNAc par chromatographie continue à deux colonnes en phase inverse
Les auteurs déclarent n’avoir aucun intérêt financier concurrent ou relation personnelle connue qui aurait pu influencer le travail. Jörg Lill, Martin Olbrich et Pascal Schmidt travaillent chez F. Hoffmann-La Roche Ltd., qui a financé l’étude ; Richard Weldon et Thomas Müller-Späth travaillent chez YMC ChromaCon.
Citation (BibTeX)
@article{weldon2022galnac,
title = {Purification d'un oligonucléotide conjugué à un cluster GalNAc par chromatographie continue à deux colonnes en phase inverse}, author = {Weldon, Richard et Lill, J{\"o}rg et Olbrich, Martin et Schmidt, Pascal et M{\"u}ller-Sp{\"a}th, Thomas}, journal = {Journal of Chromatography A},
volume = {1663},
pages = {462734},
year = {2022},
doi = {10.1016/j.chroma.2021.462734}
}
Le problème a une forme familière. Élargissez la fenêtre de collecte et le rendement augmente tandis que la pureté diminue ; réduisez-la et la pureté augmente tandis que le rendement diminue. Pour un oligonucléotide, les impuretés différant de la cible par un seul nucléotide ont tendance à co-éluer avec elle, ce qui rend ce compromis coûteux. L’étude rapporte qu’une pureté cible de qualité clinique de plus de 90 % coûte généralement entre 20 % et 50 % du produit, suivie d’une re-chromatographie coûteuse pour en récupérer une partie.
Cette perte ne reste pas dans la suite de chromatographie. La synthèse en phase solide est le principal facteur de coût dans la production d’oligonucléotides, donc tout ce que la purification abandonne doit être produit en premier lieu.
Cette étude prend une méthode par lots en phase inverse pour un gapmer ADN-LNA conjugué à un cluster GalNAc et la convertit en MCSGP à deux colonnes. Le rendement passe de 52,70 % à 91,58 % avec la même pureté — 94,2 % en surface, à partir d’un brut de 77,5 % en surface — avec une productivité et une consommation de tampon essentiellement inchangées.
Il est décrit comme la première évaluation du MCSGP pour un gapmer conjugué à un cluster GalNAc en mode phase inverse, et il étend le résultat à une estimation de mise à l’échelle : ce que ce rendement représente en kilogrammes de synthèse par jour.
1. Pourquoi cette étude est importante : la synthèse est là où se trouve le coût
La production d’oligonucléotides se déroule en quatre étapes principales : synthèse en phase solide, purification chromatographique, dessalement par diafiltration ou précipitation, et isolement par lyophilisation. L’étude est directe quant à l’emplacement des coûts : la synthèse d’oligonucléotides est actuellement le principal facteur de coût, et toute perte de produit dans les étapes en aval a un impact majeur sur les coûts de fabrication globaux.
Elle encadre également le problème d’échelle. La demande de capacité de production augmente rapidement, mais les thérapies oligonucléotidiques n’ont pas encore été fabriquées à l’échelle de plusieurs tonnes et il n’existe pas d’installations de production dédiées aux composés — c’est pourquoi les entreprises pharmaceutiques et les CMO évaluent activement les technologies de plateforme qui optimiseront la production et réduiront les coûts.
Pourquoi la séparation est difficile
La synthèse fournit environ 60 % à 80 % du produit désiré, accompagné d’un mélange d’impuretés, qui se répartissent en trois familles :
- Shortmers Séquences auxquelles il manque un ou plusieurs nucléotides (N-x), laissées par des réactions de couplage chimique incomplètes pendant l’élongation.
- Impuretés du produit pleine longueur Molécules de la bonne longueur présentant un défaut — modification cyanoéthyle, impureté phosphate, dépurination — produites par des réactions secondaires de modification.
- Longmers Séquences avec du matériel supplémentaire, telles que les lambdamers et les branchmers, résultant d’impuretés présentes dans les matières premières de départ.
N-1 et N+1 sont considérés comme particulièrement difficiles : un nucléotide plus court ou plus long que la cible, chimiquement presque identiques, et ayant donc tendance à co-éluer. Même après une optimisation considérable, une méthode par lots préparative laisse des impuretés co-éluant significativement avec le produit, en particulier pour les séquences fortement phosphorothiolées. Atteindre les spécifications signifie donc fractionner soigneusement et accepter que les fractions latérales soient soit éliminées, soit re-chromatographiées à un coût — productivité plus faible, plus de tampon, stockage intermédiaire, contrôle qualité supplémentaire.
Recyclage, mais pas le type habituel
Le MCSGP n’est pas la seule façon de recycler. Le recyclage en régime permanent et le recyclage en boucle fermée le font aussi, et l’article établit une distinction spécifique. Dans ces processus à colonne unique, le profil chromatographique passe à travers une pompe à chaque cycle, ce qui peut être préjudiciable à la stabilité du produit et limite le processus à un fonctionnement isocratique. Dans le MCSGP, les fractions latérales recyclées sont entièrement adsorbées sur la deuxième colonne, puis soumises à une nouvelle élution par gradient, de sorte que le produit et les impuretés ne passent par une pompe que pendant l’étape de chargement. Les auteurs soutiennent que cela rend le MCSGP bien adapté aux molécules complexes telles que les oligonucléotides.
2. L’étude en bref
La molécule est un gapmer ADN-LNA conjugué à un cluster bislysine GalNAc — le ligand glucidique qui transporte les oligonucléotides synthétiques dans les hépatocytes par endocytose, permettant le développement de traitements ciblant les maladies du foie. Elle a été assemblée par chimie standard des phosphoramidites en phase solide à une échelle de 2,0 mmol, puis conjuguée au cluster GalNAc en phase solution. Le brut est entré en purification à 77,5 % en surface par RP-HPLC.
Rendement du produit conforme aux spécifications, contre 52,7 % pour la référence par lots
Pureté du produit en % de surface, enrichie à partir d’un brut de 77,5 % en surface
Étape de synthèse d’oligonucléotides plus petite pour la même production quotidienne, dans l’estimation de mise à l’échelle
Productivité en g/Lrésine/h — essentiellement inchangée par rapport au processus par lots
Ce qui a été exécuté, et sur quoi
La référence discontinue
Une méthode préparative en phase inverse sur une colonne YMC Triart Prep C8-S, 150 × 10 mm d.i., 10 µm, 12 nm, à 45 °C. Les phases mobiles étaient l’acétonitrile contre 0,2 M d’acétate de sodium. La charge était de 2,52 g par litre de résine ; des charges plus élevées ont donné une pureté de produit insuffisante, bien que ces données ne soient pas présentées. Les fractions d’élution ont été analysées par HPLC pour la pureté et par Nanodrop pour la concentration.
Le processus continu
MCSGP sur un Contichrom CUBE 30 avec deux colonnes de la même résine C8 et la même hauteur de lit de 15 cm, à 45 °C, avec UV enregistré à 300 nm après chaque sortie de colonne. La méthode a été conçue à partir du chromatogramme par lots à l’aide de l’assistant MCSGP et exécutée pendant six cycles, donnant douze élutions de produit.
Deux simplifications délibérées distinguent la méthode continue de sa parente par lots. Le lavage après chargement a été supprimé, car l’étape de recyclage fort le remplace efficacement. Et la régénération, que le processus par lots effectue après chaque élution, n’a été appliquée qu’à la fin de l’exécution MCSGP — sans impact négatif évident sur les performances du processus.
3. Ce que le rendement apporte en amont
À une pureté équivalente d’environ 94 % en surface, le processus par lots a récupéré 52,70 % du produit chargé et le MCSGP a récupéré 91,58 %. La question intéressante est de savoir ce que cette différence vaut une fois le processus mis à l’échelle, et l’étude y répond par une estimation simplifiée construite autour d’une seule colonne par lots de 60 cm produisant 1,3 kg de produit par jour.
- Produit contenu dans le brut
- Impuretés dans le brut
- Produit récupéré
Le processus de référence. Une seule colonne de 60 cm traite 3 200 g de brut par jour et restitue 1 307 g de produit. Le brut contient 77,5 % de produit, donc la bande plus foncée représente ce qui était disponible à récupérer — et un peu plus de la moitié est extraite. La synthèse doit être dimensionnée pour couvrir le reste.
- Brut en entrée
- 3 200 g/jour
- Produit en sortie
- 1 307 g/jour
- Résine
- 42 L
- Tampon
- 12 534 L/jour
Scénarios tels que rapportés dans le tableau 4 de l’étude, réorganisés à une seule échelle de masse afin que les barres puissent être comparées directement. Il s’agit d’estimations simplifiées de mise à l’échelle plutôt que de productions réelles. Le rouge marque le produit, suivant la convention de couleur utilisée dans les figures 1 et 2 de l’article.
L’étude est équitable concernant le premier scénario. Deux colonnes de 60 cm contiennent 70 L de résine entre elles contre 42 L pour la colonne unique par lots, donc la production supplémentaire n’est pas gratuite. Les auteurs soulignent qu’un processus par lots utilisant le même volume total de résine pourrait produire 2 614 g/jour — mais nécessiterait deux fois plus d’alimentation, soit 6 400 g/jour, pour y parvenir. La comparaison qui isole l’avantage de rendement est la troisième : même produit en sortie, même résine totale, 42,5 % de brut en moins en entrée.
Une analogie simple
Un distillateur prélève un cœur de coupe de chaque passe et met de côté les têtes et les queues à chaque extrémité. Si le cœur est étroit, l’esprit est pur mais il y en a peu ; s’il est large, il y en a plus, mais il contient des notes indésirables. C’est le même choix qu’un chromatographe fait au collecteur de fractions.
Les distillateurs ne jettent pas les têtes et les queues — elles retournent dans la charge suivante. C’est ce que font les phases de recyclage ici. Parce que les fractions latérales retournent à la deuxième colonne, le cœur peut être coupé étroitement pour la pureté sans que le rendement ne soit sacrifié.
4. Conception du processus continu
Le MCSGP est conçu en divisant un chromatogramme de gradient par lots en quatre phases qui constituent un cycle. L’exécution par lots n’est pas seulement une référence dans cette étude ; c’est le modèle de conception, c’est pourquoi l’article note que le processus par lots devrait déjà atteindre la pureté cible avec une bonne productivité et une consommation de tampon acceptable avant que la conversion ne commence. Un processus par lots avec un rendement entre 20 % et 80 % est décrit comme un bon point de départ.
- P1 — colonnes en parallèle Les impuretés faiblement adsorbantes éluent de la colonne 1 vers les déchets, tandis que la colonne 2 est régénérée et prête pour le chargement.
- P2 — colonnes interconnectées Le mélange d’impuretés faiblement adsorbantes et de produit élue de la colonne 1 et est recyclé, avec dilution en ligne, directement sur la colonne 2.
- P3 — colonnes en parallèle Le produit pur est collecté de la colonne 1 tandis qu’une nouvelle alimentation est chargée sur la colonne 2. Pour maintenir un état stationnaire cycle à cycle, la quantité de nouvelle alimentation appliquée est en équilibre avec le produit retiré — une charge que le logiciel calcule à partir du chromatogramme par lots et de l’analyse des fractions.
- P4 — colonnes interconnectées Le mélange de produit et d’impuretés fortement adsorbantes est recyclé sur la colonne 2 de la même manière que P2. Les colonnes échangent ensuite leurs positions et la séquence se répète.
La définition des limites est là où le jugement intervient. P3 a été positionné pour atteindre la pureté cible de plus de 94 % en surface, calculée par l’assistant, et P2 et P4 ont été positionnés pour recycler entièrement les fractions latérales de pureté inférieure. Parce que N-1 et N+1 sont structurellement si proches de la cible et donc difficiles à éliminer, leur abondance à travers le pic a également été vérifiée, afin que la fenêtre de collecte du produit puisse être placée pour les minimiser.
L’assistant a ensuite calculé les débits de dilution en ligne nécessaires pour ramener la concentration du modificateur de l’éluat aux conditions de chargement initiales — essentiel si le produit recyclé d’une colonne doit se réadsorber entièrement sur l’autre — ainsi que les paramètres de chargement requis pour établir un état stationnaire cyclique. Il a produit trois méthodes : un démarrage qui précharge la colonne amont comme le ferait un processus par lots, une méthode principale de six cycles MCSGP, et un arrêt consistant en un seul cycle avec une élution finale du produit mais sans alimentation.
5. Ce que six cycles ont montré
Six cycles ont été exécutés, chacun comprenant deux commutations, pour un total de douze élutions de produit. La question à laquelle un processus continu doit répondre est de savoir s’il se stabilise, et si quelque chose s’accumule pendant ce temps.
La hauteur du profil UV à l’intérieur de la fenêtre de collecte du produit P3 est restée constante du cycle 1 au cycle 6, ce qui indique que le matériau entrant dans le système était en équilibre avec le matériau en sortant. Les changements visibles au cours des premiers cycles se situaient dans les fenêtres de recyclage P2 et P4, où les impuretés s’accumulent et mettent plusieurs cycles à atteindre l’état stationnaire.
L’accumulation dans les fenêtres de recyclage est attendue. Elle n’est importante que si les impuretés s’accumulent vers le pool de produit : si elles s’accumulent dans la direction de P3, la pureté diminue de cycle en cycle et le produit peut tomber en dessous des spécifications. Placer les limites de phase de manière appropriée pendant la conception est ce qui évite ou contrôle cela.
Les six cycles ont donc été analysés, par HPLC pour la pureté et par Nanodrop pour la concentration. La concentration s’est maintenue autour de 2,7 g/L et la pureté totale est restée constamment supérieure à 94 % en surface tout au long de l’exécution, et ni N-1 ni N+1 n’ont montré d’accumulation. Sur cette base, les auteurs concluent que les paramètres du processus sont bien conçus en ce qui concerne la qualité du produit. La comparaison du produit final regroupé de tous les six cycles avec le matériau d’entrée montre un enrichissement de 77,5 % en surface à 94,2 % en surface.
Pourquoi les chiffres rapportés sont des valeurs d’état stationnaire
Une chose à lire attentivement. Le démarrage et l’arrêt coûtent tous deux en performance, car la charge appliquée pendant le démarrage contient plus de produit que ce qui est récupéré lors de l’arrêt final, et l’arrêt ne recycle pas ses fractions latérales — ce qui le rend analogue à une exécution par lots en termes de perte de produit. Avec seulement six cycles exécutés, les auteurs ont restreint la comparaison des performances à l’état stationnaire, c’est-à-dire les performances du processus si le nombre de cycles était infini. Ils décrivent cela comme le scénario le plus favorable, et déclarent qu’en pratique, une exécution de plus de 20 cycles serait très similaire.
6. Résultats complets
Faites glisser le tableau latéralement pour voir les colonnes d’alimentation, par lots et MCSGP.
| Métrique | Alimentation | Lots | MCSGP |
|---|---|---|---|
| Spécification du gapmer ADN-LNA conjugué au GalNAc >94 % en surface · Les chiffres MCSGP sont des valeurs d’état stationnaire | |||
| Pureté du produit (% en surface) | 77,48 | 94,22 | 94,16 |
| Impureté N-1 (% en surface) | 3,36 | 0,93 | 0,87 |
| Impureté N+1 (% en surface) | 4,23 | 1,22 | 1,41 |
| Rendement (%) | — | 52,70 | 91,58 |
| Productivité (g/Lrésine/h) | — | 1,30 | 1,33 |
| Consommation de tampon (L/g) | — | 9,59 | 9,22 |
| Concentration du produit (g/L) | — | 3,25 | 2,71 |
| Charge par cycle (g/L résine) | — | 2,52 | 1,83 |
Valeurs du tableau 3 de l’étude, réorganisées. Weldon, Lill, Olbrich, Schmidt et Müller-Späth, J. Chromatogr. A 2022, 1663, 462734, publié sous CC BY-NC-ND 4.0.
Où les deux processus diffèrent, et où ils ne diffèrent pas
Le rendement est le changement. Presque tout le reste est quasiment inchangé : la pureté est ajustée par conception à environ 94 % en surface, la productivité est de 1,33 contre 1,30 g/Lrésine/h, et la consommation de tampon est de 9,22 contre 9,59 L par gramme de produit. Le N-1 est ressorti légèrement plus bas en MCSGP et le N+1 légèrement plus haut.
Deux chiffres ont évolué dans le mauvais sens, et les deux sont reconnus. La concentration du produit était 17 % plus faible en MCSGP, ce que les auteurs signalent comme une marge de manœuvre pour réduire les volumes d’éluat. Et la charge MCSGP était inférieure à la charge par lots, 1,83 contre 2,52 g par litre de résine — non pas parce que c’était optimal mais parce que l’optimisation de la charge ne faisait pas partie de l’étude. Des expériences par lots ont qualitativement indiqué que de petites augmentations de charge entraînaient une perte de rendement supplémentaire, ce qui suggère que la capacité de liaison de la résine était déjà largement utilisée.
Scénarios de mise à l’échelle
Faites glisser le tableau latéralement pour voir les trois scénarios.
| Paramètre | Lots | MCSGP, même alimentation | MCSGP, même production |
|---|---|---|---|
| Alimentation en entrée à 77,5 % de pureté (g/jour) | 3 200 | 3 200 | 1 841 |
| Quantité de production (g/jour) | 1 307 | 2 270 | 1 307 |
| Diamètre intérieur de la colonne | 60 cm | 2 × 60 cm | 2 × 45 cm |
| Volume de résine requis | 42 L | 2 × 35 L | 2 × 21 L |
| Taille de la pompe sur le skid | 15 L/min | 16 L/min | 8 L/min |
| Demande quotidienne de tampon | 12 534 L | 20 929 L | 12 050 L |
Valeurs du tableau 4 de l’étude, réorganisées. Il s’agit d’estimations simplifiées de mise à l’échelle, non de productions réelles.
7. Ce que cela signifie pour la fabrication
L’estimation de mise à l’échelle est l’endroit où le chiffre de rendement devient un argument opérationnel. Produire les mêmes 1,3 kg de produit par jour à partir de 1 841 g de brut au lieu de 3 200 g signifie que les étapes précédentes, y compris la synthèse d’oligonucléotides, peuvent être réduites de 42,5 % — ou, lu dans l’autre sens, la même quantité de produit peut être fabriquée 42,5 % plus rapidement.
Le tableau des équipements est mitigé. Dans le scénario de même production, les deux colonnes MCSGP contiennent la même quantité totale de résine que la colonne unique par lots, avec un diamètre intérieur plus petit, et le diamètre plus petit permet d’utiliser des pompes plus petites sur le skid pour atteindre le même débit linéaire. Comme le MCSGP utilise un équipement similaire avec un encombrement comparable à la chromatographie par lots, les auteurs considèrent qu’il est faisable d’équiper les installations existantes.
Au-delà du rendement, l’article énumère trois avantages supplémentaires. La re-chromatographie des fractions latérales n’est plus nécessaire, ce qui supprime une étape qui améliore les rendements par lots mais diminue la productivité globale, augmente la consommation de tampon et exige une manipulation manuelle et un espace de stockage. La charge analytique peut diminuer : un processus par lots stable nécessite la collecte et l’analyse d’un minimum de trois pools, davantage lorsque la collecte du produit est moins robuste et encore plus après re-chromatographie, tandis que le MCSGP génère généralement un seul pool de produit par cycle et il peut suffire de regrouper et d’analyser tous les quelques cycles. Et moins d’intervention humaine est nécessaire pendant la production, donc moins de personnel est requis.
En contrepartie, l’article nomme clairement son propre compromis : une complexité accrue de l’équipement et de la validation, car une configuration MCSGP utilise deux colonnes et double approximativement la quantité de matériel.
Une conversion équivalente en mode échange d’anions, sur un brin sens d’siRNA conjugué, est rapportée dans une étude complémentaire de cette série. Pour une vue d’ensemble de la plateforme où le MCSGP s’intègre dans un flux de travail d’oligonucléotides, voir purification d’oligonucléotides avec MCSGP.
Ce que l’étude ne prétend pas
- Les chiffres MCSGP sont des valeurs d’état stationnaire. Seuls six cycles ont été exécutés, et la comparaison exclut l’impact sur les performances du démarrage et de l’arrêt. Les auteurs décrivent cela comme le scénario le plus favorable — les performances du processus comme si le nombre de cycles était infini — et déclarent qu’une exécution de plus de 20 cycles serait très similaire. Le rendement, la productivité et la consommation de tampon rapportés doivent être lus sur cette base.
- La charge n’a pas été optimisée. Le MCSGP a fonctionné à 1,83 g/L de résine contre 2,52 pour les lots. L’optimisation de la charge ne faisait pas partie de l’étude, et des expériences par lots ont qualitativement suggéré que de petites augmentations de charge entraînaient une perte de rendement.
- La concentration du produit était 17 % plus faible. Les auteurs identifient cela comme une marge de manœuvre pour l’amélioration de la méthode afin de réduire les volumes d’éluat.
- Le N+1 était légèrement plus élevé. 1,41 % en surface dans le pool MCSGP contre 1,22 dans le pool par lots, bien que le N-1 ait été légèrement plus bas à 0,87 contre 0,93.
- Plus de matériel, plus de validation. L’article énonce directement le compromis : deux colonnes et environ le double des composants matériels entraînent une complexité accrue de l’équipement et de la validation.
- La mise à l’échelle est une estimation. Les trois scénarios sont un calcul simplifié des performances mesurées, non des productions réelles.
- Financement et affiliations. L’étude a été financée par F. Hoffmann-La Roche Ltd., où travaillent trois des cinq auteurs ; les deux autres sont chez YMC ChromaCon, qui commercialise le MCSGP. Les auteurs déclarent n’avoir aucun intérêt financier concurrent ou relation personnelle connue qui aurait pu influencer le travail.
8. Termes clés de cette étude (Glossaire)
| Terme | Définition |
|---|---|
| Cœur de coupe | La portion centrale d’un pic d’élution par lots qui satisfait aux spécifications de pureté et est collectée comme produit. Les fractions de part et d’autre sont les fractions latérales. |
| Recyclage en boucle fermée (CLR) | Une technique de recyclage à colonne unique dans laquelle le profil chromatographique repasse à travers une pompe à chaque cycle. Limitée à un fonctionnement isocratique, et le passage répété par la pompe peut affecter la stabilité du produit. |
| État stationnaire cyclique | La condition dans laquelle chaque cycle MCSGP reproduit le précédent, avec le matériau entrant dans le système en équilibre avec le matériau en sortant. |
| Gapmer | Une conception d’oligonucléotide antisens avec un segment d’ADN central flanqué de nucléotides modifiés — ici de l’acide nucléique bloqué — qui confèrent une stabilité tandis que le segment central reste actif contre la cible d’ARN. |
| Cluster GalNAc | Un ligand N-acétylgalactosamine conjugué à un oligonucléotide, assurant le transport dans les hépatocytes par endocytose et permettant ainsi le développement de traitements ciblant les maladies du foie. |
| Dilution en ligne | Dilution du flux recyclé entre des colonnes interconnectées, ramenant la concentration du modificateur aux conditions de chargement initiales afin que le produit recyclé se réadsorbe entièrement sur la colonne en aval. |
| LNA | Acide nucléique bloqué, un analogue nucléotidique avec un cycle ribose contraint, utilisé pour augmenter la stabilité et l’affinité cible des oligonucléotides synthétiques. |
| Longmer | Une séquence plus longue que la cible, telle qu’un lambdamer ou un branchmer, résultant d’impuretés dans les matières premières de départ. |
| MCSGP | Purification par gradient de solvant à contre-courant multicolonne : un processus de chromatographie continue à deux colonnes qui recycle en interne les fractions latérales impures, de sorte que seul le produit conforme aux spécifications quitte le système. |
| N-1 et N+1 | Impuretés un nucléotide plus court et un nucléotide plus long que la cible. Structurellement très proches du produit et donc difficiles à en séparer. |
| P1 à P4 | Les quatre phases d’un cycle MCSGP : impuretés faibles vers les déchets, recyclage côté faible, collecte du produit avec alimentation simultanée, et recyclage côté fort. |
| Phosphorothioate | Une modification du squelette remplaçant un oxygène par du soufre pour résister à la dégradation. Les séquences fortement phosphorothiolées sont notées comme étant particulièrement sujettes aux impuretés co-éluant avec le produit. |
| Re-chromatographie | Re-exécuter les fractions latérales de pureté inférieure pour récupérer davantage de produit. Cela augmente le rendement par lots mais diminue la productivité, augmente la consommation de tampon et ajoute des manipulations, du stockage et un contrôle qualité. |
| Shortmer | Une séquence à laquelle il manque un ou plusieurs nucléotides, désignée N-x, produite par un couplage chimique incomplet pendant la synthèse. |
| Démarrage et arrêt | Les méthodes qui débutent et terminent une exécution MCSGP. Le démarrage précharge la première colonne ; l’arrêt effectue une élution finale sans alimentation et sans recycler ses fractions latérales. |
| Recyclage en régime permanent (SSR) | Une technique de recyclage à colonne unique liée au recyclage en boucle fermée, partageant la même limitation que le profil passe à travers une pompe à chaque cycle. |
| Commutation et cycle | Une commutation est une élution de produit d’une colonne, composée des phases P1 à P4. Un cycle est composé de deux commutations, avec une élution de produit de chacune des deux colonnes. |
| Compromis rendement-pureté | La relation inverse en chromatographie par lots entre la quantité de produit collectée et la pureté du pool, définie par les performances de séparation et l’endroit où les limites de collecte sont tracées. |
9. Foire aux questions
Oui. Cette étude rapporte la première évaluation du MCSGP pour un gapmer ADN-LNA conjugué à un cluster GalNAc en mode phase inverse. Partant d’une méthode par lots établie sur la même résine C8 et les mêmes phases mobiles acétonitrile et acétate de sodium, le processus continu a atteint un rendement de 91,58 % avec une pureté de 94,16 % en surface, contre un rendement de 52,70 % avec une pureté de 94,22 % en surface pour la référence par lots.
Dans ce cas, le rendement est passé de 52,70 % à 91,58 % à pureté équivalente — une amélioration relative de 73,6 %. L’ampleur du gain dépend du processus par lots dont il est issu : un processus par lots avec un rendement entre 20 % et 80 % est décrit comme un bon point de départ pour le développement du MCSGP, de sorte qu’une méthode par lots qui récupère déjà la majeure partie de son produit a moins de marge d’amélioration.
La synthèse. La synthèse d’oligonucléotides est le principal facteur de coût dans la production, et son ampleur est déterminée par la quantité de produit que la purification est censée perdre. Dans l’estimation de mise à l’échelle de l’étude, les mêmes 1 307 g de produit quotidien pourraient être fabriqués à partir de 1 841 g de brut au lieu de 3 200 g — permettant de réduire les étapes précédentes, y compris la synthèse, de 42,5 %. Lu dans l’autre sens, la même production pourrait être réalisée 42,5 % plus rapidement.
Pas dans cette étude. La productivité était de 1,33 g/Lrésine/h pour le MCSGP contre 1,30 pour les lots, et la consommation de tampon de 9,22 L/g contre 9,59 — les deux étant essentiellement inchangées. Deux chiffres ont évolué dans le mauvais sens : la concentration du produit était 17 % plus faible, et l’impureté N+1 était légèrement plus élevée à 1,41 % en surface contre 1,22.
Dans le recyclage en régime permanent et le recyclage en boucle fermée, le profil chromatographique passe à travers une pompe à chaque cycle, ce qui peut être préjudiciable à la stabilité du produit et limite ces processus à un fonctionnement isocratique. Dans le MCSGP, les fractions latérales recyclées sont entièrement adsorbées sur une deuxième colonne, puis soumises à une nouvelle élution par gradient, de sorte que le produit et les impuretés ne passent par une pompe que pendant l’étape de chargement. Les auteurs soutiennent que cela rend le MCSGP bien adapté aux molécules complexes telles que les oligonucléotides.
Plus que ceux exécutés ici, pour voir tous les avantages. Le démarrage et l’arrêt réduisent tous deux les performances globales, car la charge de démarrage contient plus de produit que l’arrêt n’en récupère et l’arrêt ne recycle pas ses fractions latérales. L’article indique qu’exécuter plus de 20 cycles est idéal pour minimiser leur impact relatif. Comme seulement six cycles ont été exécutés dans cette étude, les chiffres de performance rapportés décrivent l’état stationnaire plutôt qu’une moyenne sur l’ensemble de l’exécution.
La chimie reste la même. Cette étude a utilisé la même phase stationnaire C8 et les mêmes phases mobiles acétonitrile et acétate de sodium que la méthode par lots, avec deux simplifications délibérées : le lavage après chargement a été supprimé, puisque l’étape de recyclage fort le remplace, et la régénération n’a été appliquée qu’à la fin de l’exécution plutôt qu’après chaque élution. L’équipement est le compromis — le MCSGP utilise deux colonnes et double approximativement les composants matériels, entraînant une complexité accrue de l’équipement et de la validation, bien que l’encombrement soit comparable à la chromatographie par lots.
Oui. Il est publié en accès libre dans Journal of Chromatography A et peut être lu et téléchargé gratuitement. Notez qu’il est sous licence CC BY-NC-ND 4.0 plutôt que CC BY utilisée par de nombreux articles en accès libre, donc la réutilisation est limitée à des fins non commerciales et ne s’étend pas aux œuvres dérivées. Du matériel supplémentaire couvrant les paramètres spécifiques de la méthode par lots et MCSGP et le gradient analytique est disponible avec l’article.
