Reversed-Phase MCSGP für GalNAc-konjugierte Oligonukleotide

@article{weldon2022galnac,
 title = {Purification of a GalNAc-cluster-conjugated oligonucleotide by reversed-phase twin-column continuous chromatography}, author = {Weldon, Richard and Lill, J{\"o}rg and Olbrich, Martin and Schmidt, Pascal and M{\"u}ller-Sp{\"a}th, Thomas}, journal = {Journal of Chromatography A},




 volume = {1663},
 pages = {462734},
 year = {2022},
 doi = {10.1016/j.chroma.2021.462734}
}

Das Problem hat eine vertraute Form. Erweitert man das Sammelfenster, steigt die Ausbeute, während die Reinheit sinkt; verengt man es, steigt die Reinheit, während die Ausbeute sinkt. Bei einem Oligonukleotid neigen Verunreinigungen, die sich vom Zielmolekül um ein einzelnes Nukleotid unterscheiden, dazu, mit diesem zu koeluieren, was diesen Kompromiss zu einem teuren macht. Die Studie berichtet von einem Reinheitsziel für klinische Qualität von mehr als 90 %, das typischerweise zwischen 20 % und 50 % des Produkts kostet, gefolgt von aufwendiger Re-Chromatographie, um einen Teil davon zurückzugewinnen.

Dieser Verlust bleibt nicht im Chromatographie-Bereich. Die Festphasensynthese ist der Hauptkostentreiber in der Oligonukleotid-Produktion, sodass alles, was die Aufreinigung aufgibt, zunächst hergestellt werden muss.

Es wird als die erste Evaluierung von MCSGP für einen GalNAc-Cluster-konjugierten Gapmer im Reversed-Phase-Modus beschrieben, und sie führt das Ergebnis bis zu einer Scale-up-Abschätzung durch: was diese Ausbeute in Kilogramm Synthese pro Tag wert ist.

1. Warum diese Studie wichtig ist: Die Synthese ist der Kostenfaktor

Die Oligonukleotid-Produktion läuft in vier Hauptschritten ab – Festphasensynthese, chromatographische Aufreinigung, Entsalzung durch Diafiltration oder Fällung und Isolierung durch Gefriertrocknung. Die Studie ist direkt bezüglich der Kostenfrage: Die Oligonukleotid-Synthese ist derzeit der Hauptkostentreiber, und jeder Verlust an Produkt in den nachgelagerten Schritten hat einen erheblichen Einfluss auf die Gesamtherstellungskosten.

Sie rahmt auch das Skalierungsproblem ein. Die Nachfrage nach Produktionskapazität expandiert rasch, aber Oligonukleotid-Therapeutika werden noch nicht im Mehrtonnen-Maßstab hergestellt, und es existieren keine substanzdedizierten Produktionsanlagen – weshalb Pharmaunternehmen und CMOs aktiv Plattformtechnologien evaluieren, die die Produktion optimieren und Kosten senken werden.

Warum die Trennung schwierig ist

Die Synthese liefert etwa 60 % bis 80 % gewünschtes Produkt neben einem Gemisch von Verunreinigungen, und diese fallen in drei Familien:

• Shortmers Sequenzen, denen ein oder mehrere Nukleotide fehlen (N-x), die durch unvollständige chemische Kupplungsreaktionen während der Elongation zurückbleiben.
• Volllängen-Produktverunreinigungen Moleküle der richtigen Länge mit einem Defekt – Cyanoethyl-Modifikation, Phosphat-Verunreinigung, Depurinierung –, die durch modifizierende Nebenreaktionen entstehen.
• Longmers Sequenzen mit zusätzlichem Material, wie Lambdamere und Branchmere, die aus Verunreinigungen in den Ausgangsrohstoffen entstehen.

N-1 und N+1 werden als besonders herausfordernd hervorgehoben: ein Nukleotid kürzer oder länger als das Zielmolekül, chemisch nahezu identisch und daher zur Koelution neigend. Selbst nach erheblicher Optimierung hinterlässt eine präparative Batch-Methode Verunreinigungen, die signifikant mit dem Produkt koeluieren, insbesondere bei stark phosphorothiolierten Sequenzen. Die Einhaltung der Spezifikation bedeutet daher sorgfältiges Fraktionieren und die Akzeptanz, dass die Seitenfraktionen entweder verworfen oder mit Kosten re-chromatographiert werden – geringere Produktivität, mehr Puffer, Zwischenlagerung, zusätzliche Qualitätskontrolle.

Recycling, aber nicht die übliche Art

MCSGP ist nicht die einzige Möglichkeit zu recyceln. Steady-State-Recycling und Closed-Loop-Recycling tun dies ebenfalls, und das Paper zieht eine spezifische Unterscheidung. In diesen Einsäulenprozessen durchläuft das chromatographische Profil in jedem Zyklus eine Pumpe, was möglicherweise nachteilig für die Produktstabilität ist und die Prozesse auf isokratischen Betrieb beschränkt. Bei MCSGP werden die recycelten Seitenfraktionen vollständig auf der zweiten Säule adsorbiert und dann einer erneuten Gradientenelution unterzogen, sodass Produkt und Verunreinigungen nur während des Beladungsschritts eine Pumpe durchlaufen. Die Autoren argumentieren, dass dies MCSGP gut für komplexe Moleküle wie Oligonukleotide geeignet macht.

2. Die Studie auf einen Blick

Das Molekül ist ein DNA-LNA-Gapmer, konjugiert mit einem Bislysin-GalNAc-Cluster – dem Zucker-Liganden, der synthetische Oligonukleotide durch Endozytose in Hepatozyten transportiert und die Entwicklung von Behandlungen für Lebererkrankungen ermöglicht. Es wurde durch Standard-Phosphoramidit-Chemie in fester Phase im 2,0-mmol-Maßstab assembliert und dann in Lösungsphase mit dem GalNAc-Cluster konjugiert. Das Rohprodukt trat mit 77,5 Flächen-% nach RP-HPLC in die Aufreinigung ein.

Was gefahren wurde und worauf

Zwei bewusste Vereinfachungen unterscheiden die kontinuierliche Methode von ihrem Batch-Vorbild. Der Waschschritt nach der Beladung wurde weggelassen, da der starke Recycling-Schritt effektiv dafür substituiert. Und die Regeneration, die der Batch-Prozess nach jeder Elution durchführt, wurde nur am Ende des MCSGP-Laufs angewendet – ohne erkennbare negative Auswirkungen auf die Prozessleistung.

3. Was die Ausbeute vorgelagert bringt

Bei einer abgestimmten Reinheit von etwa 94 Flächen-% gewann der Batch-Prozess 52,70 % des beladenen Produkts zurück und MCSGP 91,58 %. Die interessante Frage ist, was dieser Unterschied wert ist, sobald der Prozess skaliert wird, und die Studie beantwortet sie mit einer vereinfachten Abschätzung, die um eine einzelne 60-cm-Batch-Säule herum aufgebaut ist, die 1,3 kg Produkt pro Tag produziert.

Die Studie ist ausgewogen bezüglich des ersten Szenarios. Zwei 60-cm-Säulen enthalten zusammen 70 L Harz gegenüber 42 L für die einzelne Batch-Säule, sodass die zusätzliche Produktion nicht kostenlos ist. Die Autoren weisen darauf hin, dass ein Batch-Prozess mit demselben Gesamtharzvolumen 2.614 g/Tag liefern könnte – aber dafür die doppelte Zufuhr, 6.400 g/Tag, benötigen würde. Der Vergleich, der den Ausbeutevorteil isoliert, ist der dritte: gleiche Produktmenge heraus, gleiches Gesamtharz, 42,5 % weniger Rohprodukt hinein.

4. Auslegung des kontinuierlichen Prozesses

MCSGP wird ausgelegt, indem ein Batch-Gradienten-Chromatogramm in vier Phasen unterteilt wird, die einen Switch bilden. Der Batch-Lauf ist in dieser Studie nicht nur ein Benchmark; er ist die Auslegungsvorlage, weshalb das Paper anmerkt, dass der Batch-Prozess bereits die Zielreinheit mit guter Produktivität und akzeptablem Pufferverbrauch erreichen sollte, bevor die Umstellung beginnt. Ein Batch-Prozess mit einer Ausbeute zwischen 20 % und 80 % wird als guter Ausgangspunkt beschrieben.

• P1 – Säulen parallel Schwach adsorbierende Verunreinigungen eluieren von Säule 1 zum Abfall, während Säule 2 regeneriert und für die Beladung bereit gemacht wird.
• P2 – Säulen verbunden Das Gemisch aus schwach adsorbierenden Verunreinigungen und Produkt eluiert von Säule 1 und wird mit Inline-Verdünnung direkt auf Säule 2 recycelt.
• P3 – Säulen parallel Reines Produkt wird von Säule 1 gesammelt, während frische Zufuhr auf Säule 2 geladen wird. Um einen Switch-zu-Switch-Steady-State zu halten, ist die Menge der neuen Zufuhr im Gleichgewicht mit dem entfernten Produkt – eine Beladung, die die Software aus dem Batch-Chromatogramm und der Fraktionsanalyse berechnet.
• P4 – Säulen verbunden Das Gemisch aus Produkt und stark adsorbierenden Verunreinigungen wird auf dieselbe Weise wie P2 auf Säule 2 recycelt. Die Säulen tauschen dann die Positionen und die Sequenz wiederholt sich.

Das Setzen der Grenzen ist der Punkt, an dem die Beurteilung sitzt. P3 wurde positioniert, um die Zielreinheit von mehr als 94 Flächen-% zu erreichen, berechnet durch den Wizard, und P2 und P4 wurden positioniert, um die Seitenfraktionen niedrigerer Reinheit vollständig zu recyceln. Da N-1 und N+1 strukturell so nah am Zielmolekül und entsprechend schwer zu entfernen sind, wurde ihre Häufigkeit über den Peak hinweg ebenfalls überprüft, sodass das Produktsammelfenster platziert werden konnte, um sie zu minimieren.

Der Wizard berechnete dann die Inline-Verdünnungs-Durchflussraten, die erforderlich sind, um die Modifikatorkonzentration des Eluats auf die anfänglichen Beladungsbedingungen zurückzuverdünnen – wesentlich, damit das von einer Säule recycelte Produkt vollständig auf der anderen re-adsorbiert – zusammen mit den Beladungsparametern, die erforderlich sind, um einen zyklischen Steady-State zu etablieren. Es produzierte drei Methoden: einen Startup, der die vorgelagerte Säule wie ein Batch-Prozess vorbelädt, eine Hauptmethode von sechs MCSGP-Zyklen und einen Shutdown, bestehend aus einem Switch mit einer finalen Produktelution, aber ohne Zufuhr.

5. Was sechs Zyklen zeigten

Sechs Zyklen wurden durchgeführt, jeder bestehend aus zwei Switches, für insgesamt zwölf Produktelutionen. Die Frage, die ein kontinuierlicher Prozess beantworten muss, ist, ob er sich einstellt und ob sich etwas ansammelt, während er dies tut.

Die Höhe des UV-Profils innerhalb des P3-Produktsammelfensters blieb von Zyklus 1 bis Zyklus 6 konsistent, was darauf hinweist, dass Material, das in das System eintritt, im Gleichgewicht mit Material war, das es verlässt. Die sichtbaren Änderungen über frühe Zyklen hinweg waren in den P2- und P4-Recycling-Fenstern, wo sich Verunreinigungen ansammeln und mehrere Zyklen benötigen, um den Steady-State zu erreichen.

Alle sechs Zyklen wurden daher analysiert, durch HPLC auf Reinheit und Nanodrop auf Konzentration. Die Konzentration hielt bei etwa 2,7 g/L und die Gesamtreinheit blieb über den Lauf hinweg konsistent über 94 Flächen-%, und weder N-1 noch N+1 zeigten Ansammlung. Auf dieser Basis schlussfolgern die Autoren, dass die Prozessparameter in Bezug auf Produktqualität gut ausgelegt sind. Der Vergleich des finalen gepoolten Produkts aus allen sechs Zyklen mit dem Eingangsmaterial zeigt eine Anreicherung von 77,5 Flächen-% auf 94,2 Flächen-%.

Warum die berichteten Zahlen Steady-State-Werte sind

Ein Punkt zum sorgfältigen Lesen. Startup und Shutdown kosten beide Leistung, weil die Startup-Beladung mehr Produkt enthält, als im finalen Shutdown zurückgewonnen wird, und der Shutdown seine Seitenfraktionen nicht recycelt – was ihn in Bezug auf Produktverlust einem Batch-Lauf analog macht. Da nur sechs Zyklen durchgeführt wurden, beschränkten die Autoren den Leistungsvergleich auf den Steady-State, was Prozessleistung bedeutet, wenn die Anzahl der Zyklen unendlich wäre. Sie beschreiben dies als das Best-Case-Szenario und geben an, dass in der Praxis ein Lauf von mehr als 20 Zyklen sehr ähnlich wäre.

6. Vollständige Ergebnisse

Wischen Sie die Tabelle seitwärts, um die Spalten Zufuhr, Batch und MCSGP zu sehen.

Werte aus Tabelle 3 der Studie, neu angeordnet. Weldon, Lill, Olbrich, Schmidt und Müller-Späth, J. Chromatogr. A 2022, 1663, 462734, veröffentlicht unter CC BY-NC-ND 4.0.

Wo sich die beiden Prozesse unterscheiden und wo nicht

Die Ausbeute ist die Änderung. Fast alles andere ist nahezu unverändert: Die Reinheit ist durch Auslegung bei etwa 94 Flächen-% abgestimmt, die Produktivität beträgt 1,33 gegenüber 1,30 g/L_Harz/h, und der Pufferverbrauch 9,22 gegenüber 9,59 L pro Gramm Produkt. N-1 kam bei MCSGP geringfügig niedriger heraus und N+1 geringfügig höher.

Zwei Zahlen bewegten sich in die falsche Richtung, und beide werden anerkannt. Die Produktkonzentration war bei MCSGP 17 % niedriger, was die Autoren als Spielraum zur Reduzierung der Eluatvolumina kennzeichnen. Und die MCSGP-Beladung war niedriger als die Batch-Beladung, 1,83 gegenüber 2,52 g pro Liter Harz – nicht weil das optimal war, sondern weil Beladungsoptimierung nicht Teil der Studie war. Batch-Experimente deuteten qualitativ darauf hin, dass kleine Beladungserhöhungen zu weiterem Ausbeuteverlust führten, was nahelegt, dass die Bindungskapazität des Harzes bereits weitgehend genutzt wurde.

Scale-up-Szenarien

Wischen Sie die Tabelle seitwärts, um alle drei Szenarien zu sehen.

Werte aus Tabelle 4 der Studie, neu angeordnet. Dies sind vereinfachte Scale-up-Schätzungen, keine nachgewiesenen Produktionsläufe.

7. Bedeutung für die Herstellung

Die Scale-up-Schätzung ist der Punkt, an dem der Ausbeutewert zu einem betrieblichen Argument wird. Die Produktion der gleichen 1,3 kg Produkt pro Tag aus 1.841 g Rohmaterial anstelle von 3.200 g bedeutet, dass die vorangegangenen Schritte, einschließlich der Oligonukleotidsynthese, um 42,5 % reduziert werden können – oder, anders ausgedrückt, die gleiche Produktmenge kann 42,5 % schneller hergestellt werden.

Das Bild bei der Ausrüstung ist gemischt. Im Szenario mit gleichem Output enthalten die beiden MCSGP-Säulen die gleiche Gesamtmenge an Harz wie die einzelne Batch-Säule, jedoch bei einem kleineren Innendurchmesser, und der kleinere Durchmesser ermöglicht kleinere Pumpen auf dem Skid, um die gleiche lineare Flussrate zu erreichen. Da MCSGP ähnliche Geräte mit einer vergleichbaren Stellfläche wie die Batch-Chromatographie verwendet, halten die Autoren die Ausrüstung bestehender Anlagen für machbar.

Über die Ausbeute hinaus listet das Paper drei weitere Vorteile auf. Die Re-Chromatographie von Seitenfraktionen ist nicht mehr erforderlich, wodurch ein Schritt entfällt, der zwar die Batch-Ausbeute verbessert, aber die Gesamtproduktivität verringert, den Pufferverbrauch erhöht und manuellen Aufwand sowie Lagerplatz erfordert. Der Analyseaufwand kann sinken: Ein stabiler Batch-Prozess erfordert die Entnahme und Analyse von mindestens drei Pools, mehr, wenn die Produktsammlung weniger robust ist, und noch mehr nach der Re-Chromatographie, während MCSGP typischerweise einen einzigen Produktpool pro Zyklus erzeugt und es ausreichen kann, alle paar Zyklen zu poolen und zu analysieren. Zudem ist während der Produktion weniger menschliches Eingreifen erforderlich, sodass weniger Personal benötigt wird.

Demgegenüber benennt das Paper den eigenen Kompromiss deutlich: erhöhte Komplexität bei Ausrüstung und Validierung, da ein MCSGP-Aufbau zwei Säulen verwendet und die Menge der Hardware etwa verdoppelt.

Eine gleichwertige Umstellung im Anionenaustauschmodus an einem konjugierten siRNA-Sense-Strang wird in einer Begleitstudie in dieser Serie berichtet. Für die Plattform-Ansicht, wo MCSGP in einen Oligonukleotid-Workflow passt, siehe Oligonukleotid-Aufreinigung mit MCSGP.

8. Schlüsselbegriffe in dieser Studie (Glossar)

9. Häufig gestellte Fragen