Artikelkategorie: Oligo-Aufreinigung

@article{weldon2022galnac,
 title = {Purification of a GalNAc-cluster-conjugated oligonucleotide by reversed-phase twin-column continuous chromatography}, author = {Weldon, Richard and Lill, J{\"o}rg and Olbrich, Martin and Schmidt, Pascal and M{\"u}ller-Sp{\"a}th, Thomas}, journal = {Journal of Chromatography A},




 volume = {1663},
 pages = {462734},
 year = {2022},
 doi = {10.1016/j.chroma.2021.462734}
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Das Problem hat eine vertraute Form. Erweitert man das Sammelfenster, steigt die Ausbeute, während die Reinheit sinkt; verengt man es, steigt die Reinheit, während die Ausbeute sinkt. Bei einem Oligonukleotid neigen Verunreinigungen, die sich vom Zielmolekül um ein einzelnes Nukleotid unterscheiden, dazu, mit diesem zu koeluieren, was diesen Kompromiss zu einem teuren macht. Die Studie berichtet von einem Reinheitsziel für klinische Qualität von mehr als 90 %, das typischerweise zwischen 20 % und 50 % des Produkts kostet, gefolgt von aufwendiger Re-Chromatographie, um einen Teil davon zurückzugewinnen.

Dieser Verlust bleibt nicht im Chromatographie-Bereich. Die Festphasensynthese ist der Hauptkostentreiber in der Oligonukleotid-Produktion, sodass alles, was die Aufreinigung aufgibt, zunächst hergestellt werden muss.

Es wird als die erste Evaluierung von MCSGP für einen GalNAc-Cluster-konjugierten Gapmer im Reversed-Phase-Modus beschrieben, und sie führt das Ergebnis bis zu einer Scale-up-Abschätzung durch: was diese Ausbeute in Kilogramm Synthese pro Tag wert ist.

1. Warum diese Studie wichtig ist: Die Synthese ist der Kostenfaktor

Die Oligonukleotid-Produktion läuft in vier Hauptschritten ab – Festphasensynthese, chromatographische Aufreinigung, Entsalzung durch Diafiltration oder Fällung und Isolierung durch Gefriertrocknung. Die Studie ist direkt bezüglich der Kostenfrage: Die Oligonukleotid-Synthese ist derzeit der Hauptkostentreiber, und jeder Verlust an Produkt in den nachgelagerten Schritten hat einen erheblichen Einfluss auf die Gesamtherstellungskosten.

Sie rahmt auch das Skalierungsproblem ein. Die Nachfrage nach Produktionskapazität expandiert rasch, aber Oligonukleotid-Therapeutika werden noch nicht im Mehrtonnen-Maßstab hergestellt, und es existieren keine substanzdedizierten Produktionsanlagen – weshalb Pharmaunternehmen und CMOs aktiv Plattformtechnologien evaluieren, die die Produktion optimieren und Kosten senken werden.

Warum die Trennung schwierig ist

Die Synthese liefert etwa 60 % bis 80 % gewünschtes Produkt neben einem Gemisch von Verunreinigungen, und diese fallen in drei Familien:

• Shortmers Sequenzen, denen ein oder mehrere Nukleotide fehlen (N-x), die durch unvollständige chemische Kupplungsreaktionen während der Elongation zurückbleiben.
• Volllängen-Produktverunreinigungen Moleküle der richtigen Länge mit einem Defekt – Cyanoethyl-Modifikation, Phosphat-Verunreinigung, Depurinierung –, die durch modifizierende Nebenreaktionen entstehen.
• Longmers Sequenzen mit zusätzlichem Material, wie Lambdamere und Branchmere, die aus Verunreinigungen in den Ausgangsrohstoffen entstehen.

N-1 und N+1 werden als besonders herausfordernd hervorgehoben: ein Nukleotid kürzer oder länger als das Zielmolekül, chemisch nahezu identisch und daher zur Koelution neigend. Selbst nach erheblicher Optimierung hinterlässt eine präparative Batch-Methode Verunreinigungen, die signifikant mit dem Produkt koeluieren, insbesondere bei stark phosphorothiolierten Sequenzen. Die Einhaltung der Spezifikation bedeutet daher sorgfältiges Fraktionieren und die Akzeptanz, dass die Seitenfraktionen entweder verworfen oder mit Kosten re-chromatographiert werden – geringere Produktivität, mehr Puffer, Zwischenlagerung, zusätzliche Qualitätskontrolle.

Recycling, aber nicht die übliche Art

MCSGP ist nicht die einzige Möglichkeit zu recyceln. Steady-State-Recycling und Closed-Loop-Recycling tun dies ebenfalls, und das Paper zieht eine spezifische Unterscheidung. In diesen Einsäulenprozessen durchläuft das chromatographische Profil in jedem Zyklus eine Pumpe, was möglicherweise nachteilig für die Produktstabilität ist und die Prozesse auf isokratischen Betrieb beschränkt. Bei MCSGP werden die recycelten Seitenfraktionen vollständig auf der zweiten Säule adsorbiert und dann einer erneuten Gradientenelution unterzogen, sodass Produkt und Verunreinigungen nur während des Beladungsschritts eine Pumpe durchlaufen. Die Autoren argumentieren, dass dies MCSGP gut für komplexe Moleküle wie Oligonukleotide geeignet macht.

2. Die Studie auf einen Blick

Das Molekül ist ein DNA-LNA-Gapmer, konjugiert mit einem Bislysin-GalNAc-Cluster – dem Zucker-Liganden, der synthetische Oligonukleotide durch Endozytose in Hepatozyten transportiert und die Entwicklung von Behandlungen für Lebererkrankungen ermöglicht. Es wurde durch Standard-Phosphoramidit-Chemie in fester Phase im 2,0-mmol-Maßstab assembliert und dann in Lösungsphase mit dem GalNAc-Cluster konjugiert. Das Rohprodukt trat mit 77,5 Flächen-% nach RP-HPLC in die Aufreinigung ein.

Was gefahren wurde und worauf

Zwei bewusste Vereinfachungen unterscheiden die kontinuierliche Methode von ihrem Batch-Vorbild. Der Waschschritt nach der Beladung wurde weggelassen, da der starke Recycling-Schritt effektiv dafür substituiert. Und die Regeneration, die der Batch-Prozess nach jeder Elution durchführt, wurde nur am Ende des MCSGP-Laufs angewendet – ohne erkennbare negative Auswirkungen auf die Prozessleistung.

3. Was die Ausbeute vorgelagert bringt

Bei einer abgestimmten Reinheit von etwa 94 Flächen-% gewann der Batch-Prozess 52,70 % des beladenen Produkts zurück und MCSGP 91,58 %. Die interessante Frage ist, was dieser Unterschied wert ist, sobald der Prozess skaliert wird, und die Studie beantwortet sie mit einer vereinfachten Abschätzung, die um eine einzelne 60-cm-Batch-Säule herum aufgebaut ist, die 1,3 kg Produkt pro Tag produziert.

Die Studie ist ausgewogen bezüglich des ersten Szenarios. Zwei 60-cm-Säulen enthalten zusammen 70 L Harz gegenüber 42 L für die einzelne Batch-Säule, sodass die zusätzliche Produktion nicht kostenlos ist. Die Autoren weisen darauf hin, dass ein Batch-Prozess mit demselben Gesamtharzvolumen 2.614 g/Tag liefern könnte – aber dafür die doppelte Zufuhr, 6.400 g/Tag, benötigen würde. Der Vergleich, der den Ausbeutevorteil isoliert, ist der dritte: gleiche Produktmenge heraus, gleiches Gesamtharz, 42,5 % weniger Rohprodukt hinein.

4. Auslegung des kontinuierlichen Prozesses

MCSGP wird ausgelegt, indem ein Batch-Gradienten-Chromatogramm in vier Phasen unterteilt wird, die einen Switch bilden. Der Batch-Lauf ist in dieser Studie nicht nur ein Benchmark; er ist die Auslegungsvorlage, weshalb das Paper anmerkt, dass der Batch-Prozess bereits die Zielreinheit mit guter Produktivität und akzeptablem Pufferverbrauch erreichen sollte, bevor die Umstellung beginnt. Ein Batch-Prozess mit einer Ausbeute zwischen 20 % und 80 % wird als guter Ausgangspunkt beschrieben.

• P1 – Säulen parallel Schwach adsorbierende Verunreinigungen eluieren von Säule 1 zum Abfall, während Säule 2 regeneriert und für die Beladung bereit gemacht wird.
• P2 – Säulen verbunden Das Gemisch aus schwach adsorbierenden Verunreinigungen und Produkt eluiert von Säule 1 und wird mit Inline-Verdünnung direkt auf Säule 2 recycelt.
• P3 – Säulen parallel Reines Produkt wird von Säule 1 gesammelt, während frische Zufuhr auf Säule 2 geladen wird. Um einen Switch-zu-Switch-Steady-State zu halten, ist die Menge der neuen Zufuhr im Gleichgewicht mit dem entfernten Produkt – eine Beladung, die die Software aus dem Batch-Chromatogramm und der Fraktionsanalyse berechnet.
• P4 – Säulen verbunden Das Gemisch aus Produkt und stark adsorbierenden Verunreinigungen wird auf dieselbe Weise wie P2 auf Säule 2 recycelt. Die Säulen tauschen dann die Positionen und die Sequenz wiederholt sich.

Das Setzen der Grenzen ist der Punkt, an dem die Beurteilung sitzt. P3 wurde positioniert, um die Zielreinheit von mehr als 94 Flächen-% zu erreichen, berechnet durch den Wizard, und P2 und P4 wurden positioniert, um die Seitenfraktionen niedrigerer Reinheit vollständig zu recyceln. Da N-1 und N+1 strukturell so nah am Zielmolekül und entsprechend schwer zu entfernen sind, wurde ihre Häufigkeit über den Peak hinweg ebenfalls überprüft, sodass das Produktsammelfenster platziert werden konnte, um sie zu minimieren.

Der Wizard berechnete dann die Inline-Verdünnungs-Durchflussraten, die erforderlich sind, um die Modifikatorkonzentration des Eluats auf die anfänglichen Beladungsbedingungen zurückzuverdünnen – wesentlich, damit das von einer Säule recycelte Produkt vollständig auf der anderen re-adsorbiert – zusammen mit den Beladungsparametern, die erforderlich sind, um einen zyklischen Steady-State zu etablieren. Es produzierte drei Methoden: einen Startup, der die vorgelagerte Säule wie ein Batch-Prozess vorbelädt, eine Hauptmethode von sechs MCSGP-Zyklen und einen Shutdown, bestehend aus einem Switch mit einer finalen Produktelution, aber ohne Zufuhr.

5. Was sechs Zyklen zeigten

Sechs Zyklen wurden durchgeführt, jeder bestehend aus zwei Switches, für insgesamt zwölf Produktelutionen. Die Frage, die ein kontinuierlicher Prozess beantworten muss, ist, ob er sich einstellt und ob sich etwas ansammelt, während er dies tut.

Die Höhe des UV-Profils innerhalb des P3-Produktsammelfensters blieb von Zyklus 1 bis Zyklus 6 konsistent, was darauf hinweist, dass Material, das in das System eintritt, im Gleichgewicht mit Material war, das es verlässt. Die sichtbaren Änderungen über frühe Zyklen hinweg waren in den P2- und P4-Recycling-Fenstern, wo sich Verunreinigungen ansammeln und mehrere Zyklen benötigen, um den Steady-State zu erreichen.

Alle sechs Zyklen wurden daher analysiert, durch HPLC auf Reinheit und Nanodrop auf Konzentration. Die Konzentration hielt bei etwa 2,7 g/L und die Gesamtreinheit blieb über den Lauf hinweg konsistent über 94 Flächen-%, und weder N-1 noch N+1 zeigten Ansammlung. Auf dieser Basis schlussfolgern die Autoren, dass die Prozessparameter in Bezug auf Produktqualität gut ausgelegt sind. Der Vergleich des finalen gepoolten Produkts aus allen sechs Zyklen mit dem Eingangsmaterial zeigt eine Anreicherung von 77,5 Flächen-% auf 94,2 Flächen-%.

Warum die berichteten Zahlen Steady-State-Werte sind

Ein Punkt zum sorgfältigen Lesen. Startup und Shutdown kosten beide Leistung, weil die Startup-Beladung mehr Produkt enthält, als im finalen Shutdown zurückgewonnen wird, und der Shutdown seine Seitenfraktionen nicht recycelt – was ihn in Bezug auf Produktverlust einem Batch-Lauf analog macht. Da nur sechs Zyklen durchgeführt wurden, beschränkten die Autoren den Leistungsvergleich auf den Steady-State, was Prozessleistung bedeutet, wenn die Anzahl der Zyklen unendlich wäre. Sie beschreiben dies als das Best-Case-Szenario und geben an, dass in der Praxis ein Lauf von mehr als 20 Zyklen sehr ähnlich wäre.

6. Vollständige Ergebnisse

Wischen Sie die Tabelle seitwärts, um die Spalten Zufuhr, Batch und MCSGP zu sehen.

Werte aus Tabelle 3 der Studie, neu angeordnet. Weldon, Lill, Olbrich, Schmidt und Müller-Späth, J. Chromatogr. A 2022, 1663, 462734, veröffentlicht unter CC BY-NC-ND 4.0.

Wo sich die beiden Prozesse unterscheiden und wo nicht

Die Ausbeute ist die Änderung. Fast alles andere ist nahezu unverändert: Die Reinheit ist durch Auslegung bei etwa 94 Flächen-% abgestimmt, die Produktivität beträgt 1,33 gegenüber 1,30 g/L_Harz/h, und der Pufferverbrauch 9,22 gegenüber 9,59 L pro Gramm Produkt. N-1 kam bei MCSGP geringfügig niedriger heraus und N+1 geringfügig höher.

Zwei Zahlen bewegten sich in die falsche Richtung, und beide werden anerkannt. Die Produktkonzentration war bei MCSGP 17 % niedriger, was die Autoren als Spielraum zur Reduzierung der Eluatvolumina kennzeichnen. Und die MCSGP-Beladung war niedriger als die Batch-Beladung, 1,83 gegenüber 2,52 g pro Liter Harz – nicht weil das optimal war, sondern weil Beladungsoptimierung nicht Teil der Studie war. Batch-Experimente deuteten qualitativ darauf hin, dass kleine Beladungserhöhungen zu weiterem Ausbeuteverlust führten, was nahelegt, dass die Bindungskapazität des Harzes bereits weitgehend genutzt wurde.

Scale-up-Szenarien

Wischen Sie die Tabelle seitwärts, um alle drei Szenarien zu sehen.

Werte aus Tabelle 4 der Studie, neu angeordnet. Dies sind vereinfachte Scale-up-Schätzungen, keine nachgewiesenen Produktionsläufe.

7. Bedeutung für die Herstellung

Die Scale-up-Schätzung ist der Punkt, an dem der Ausbeutewert zu einem betrieblichen Argument wird. Die Produktion der gleichen 1,3 kg Produkt pro Tag aus 1.841 g Rohmaterial anstelle von 3.200 g bedeutet, dass die vorangegangenen Schritte, einschließlich der Oligonukleotidsynthese, um 42,5 % reduziert werden können – oder, anders ausgedrückt, die gleiche Produktmenge kann 42,5 % schneller hergestellt werden.

Das Bild bei der Ausrüstung ist gemischt. Im Szenario mit gleichem Output enthalten die beiden MCSGP-Säulen die gleiche Gesamtmenge an Harz wie die einzelne Batch-Säule, jedoch bei einem kleineren Innendurchmesser, und der kleinere Durchmesser ermöglicht kleinere Pumpen auf dem Skid, um die gleiche lineare Flussrate zu erreichen. Da MCSGP ähnliche Geräte mit einer vergleichbaren Stellfläche wie die Batch-Chromatographie verwendet, halten die Autoren die Ausrüstung bestehender Anlagen für machbar.

Über die Ausbeute hinaus listet das Paper drei weitere Vorteile auf. Die Re-Chromatographie von Seitenfraktionen ist nicht mehr erforderlich, wodurch ein Schritt entfällt, der zwar die Batch-Ausbeute verbessert, aber die Gesamtproduktivität verringert, den Pufferverbrauch erhöht und manuellen Aufwand sowie Lagerplatz erfordert. Der Analyseaufwand kann sinken: Ein stabiler Batch-Prozess erfordert die Entnahme und Analyse von mindestens drei Pools, mehr, wenn die Produktsammlung weniger robust ist, und noch mehr nach der Re-Chromatographie, während MCSGP typischerweise einen einzigen Produktpool pro Zyklus erzeugt und es ausreichen kann, alle paar Zyklen zu poolen und zu analysieren. Zudem ist während der Produktion weniger menschliches Eingreifen erforderlich, sodass weniger Personal benötigt wird.

Demgegenüber benennt das Paper den eigenen Kompromiss deutlich: erhöhte Komplexität bei Ausrüstung und Validierung, da ein MCSGP-Aufbau zwei Säulen verwendet und die Menge der Hardware etwa verdoppelt.

Eine gleichwertige Umstellung im Anionenaustauschmodus an einem konjugierten siRNA-Sense-Strang wird in einer Begleitstudie in dieser Serie berichtet. Für die Plattform-Ansicht, wo MCSGP in einen Oligonukleotid-Workflow passt, siehe Oligonukleotid-Aufreinigung mit MCSGP.

8. Schlüsselbegriffe in dieser Studie (Glossar)

9. Häufig gestellte Fragen

@article{weldon2025continuous,
  title = {Continuous Purification of a Conjugated Short Interfering RNA
  Therapeutic Using Anion Exchange Twin-Column Chromatography (MCSGP)},
  author = {Weldon, Richard and Vandermeersch, Tobias
  und M{\"u}ller-Sp{\"a}th, Thomas},
  journal = {Organic Process Research \& Development},
  volume =  {29},
  number =  {6},
  pages =  {1400--1410},
  year =  {2025},
  doi = {10.1021/acs.oprd.4c00513}
}

In der Oligonukleotid-Herstellung erfolgt der teure Schritt vor der Chromatographie. Die Festphasensynthese baut die Sequenz Kopplung für Kopplung auf, und jede unvollständige Kopplung hinterlässt eine chemisch ähnliche Verunreinigung – Shortmer und Longmer, die bei der Aufreinigung von einem Zielmolekül getrennt werden müssen, dem sie stark ähneln. Produktverluste im Polishing-Schritt müssen durch zusätzliche Synthese ausgeglichen werden, was die Kosten verursacht.

Das macht die Ausbeute bei der Aufreinigung hier besonders wertvoll. Ein Polishing-Schritt, der mehr vom geladenen Material zurückgewinnt, ermöglicht eine proportionale Verkleinerung des Synthese-Batches, wodurch Reagenzien, Lösungsmittel, Abfall und Säulenvolumen reduziert werden.

Sie beschreibt zudem, wie die Umstellung erfolgte – ein softwaregestütztes Verfahren, um ein Batch-Chromatogramm in eine laufende kontinuierliche Methode zu überführen – und prognostiziert, was derselbe Prozess auf Produktionsanlagen liefern würde.

1. Warum diese Studie wichtig ist: Die Ausbeute ist die teure Variable

Oligonukleotid-Medikamente haben sich vom Versprechen zum Produkt entwickelt, mit bisher 15 Zulassungen und Hunderten von Kandidaten in klinischen Studien. Die Herstellung im kommerziellen Maßstab bleibt anspruchsvoll und teuer. Zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Berichts ist der maximale kommerzielle GMP-Maßstab auf einen Synthesemaßstab von 2.000 mmol mittels Festphasen-Oligonukleotidsynthese begrenzt, und Verluste während der Downstream-Aufreinigung schränken den maximalen Ausstoß pro Batch weiter ein.

Was Batch-Polishing kostet

Der Standard-Polishing-Schritt ist die Einzelsäulen-Ionenaustausch- oder RP-Chromatographie, wobei der reine Mittelschnitt des Chromatogramms gesammelt und der Rest beiseitegelegt wird. Da sich das Zielmolekül nicht vollständig von chemisch ähnlichen Verunreinigungen trennen lässt, müssen die weniger reinen Seitenschnitte entweder erneut verarbeitet oder verworfen werden.

• Fraktionierung und Mock-Pooling Die Ausbeuten im Batch-Modus werden maximiert, indem der Elutionspeak fraktioniert und analysiert wird, um die optimalen Grenzen für den Mittelschnitt zu finden, und anschließend mehrere Mock-Produktpools für analytische Tests und die Qualitätskontrolle erstellt werden. Das Paper beschreibt diese Aufgaben als essenziell für die Chargenfreigabe und als erheblichen Teil des gesamten Herstellungsaufwands in einer GMP-Umgebung.
• Rechromatographie von Seitenschnitten Die gängige Alternative besteht darin, die außerhalb der Spezifikation liegenden Seitenfraktionen aus mehreren Chargen zu poolen und erneut laufen zu lassen. Die Seitenschnitte werden in spezielle Lagerbeutel überführt, in einem begehbaren Gefrierschrank aufbewahrt, gepoolt und diafiltriert, um die Pufferzusammensetzung vor dem erneuten Laden anzupassen. Dies verbessert die Gesamtausbeute, verringert jedoch die Produktivität des Prozesses.
• Die Synthese muss die Differenz ausgleichen Was im Polishing-Schritt verloren geht, muss upstream ersetzt werden. Die Oligonukleotidsynthese wird hochskaliert, um die während der Aufreinigung verlorenen Produktmengen zu kompensieren, was laut Paper sehr kostspielig ist.

MCSGP adressiert dies, indem die Seitenschnitte mit geringer Reinheit intern auf eine zweite Säule rezirkuliert werden, wobei eine In-line-Verdünnung die Readsorption unterstützt, sodass eine Rechromatographie unnötig wird. Die Technik wurde bereits für eine Reihe von Biomolekülen demonstriert; diese Studie ergänzt einen Fall im Anionenaustausch-Modus an einer konjugierten siRNA, ausgehend von einem bestehenden Batch-Prozess.

2. Die Studie auf einen Blick

Das Molekül ist der Sense-Strang einer therapeutischen siRNA, synthetisiert durch Standard-Phosphoramidit-Chemie an der Festphase, wobei die Zuckerkonjugation während der Synthese erfolgte. Das Rohmaterial ging mit einer Produktreinheit von 85 Flächen-% in die Aufreinigung, wobei die kritische N-1-Shortmer-Verunreinigung bei 0,93 Flächen-% lag, bei einer Zielreinheitsspezifikation von mehr als 95 %.

Was gefahren wurde und worauf

Beide Eluenten waren von der gleichen Art: 20 mM Natriumphosphat mit 10 Vol.-% Acetonitril bei pH 8,0, wobei Natriumchlorid den Gradienten lieferte. Die Pilotmethode verwendete 0,9 M NaCl in der mobilen Phase B und die Downscale-Läufe 1,1 M, was in den Downscale-Läufen zu einem schmaleren Peak führte – ein Unterschied, von dem die Autoren erwarteten, dass die interne Rezirkulierung ihn kompensieren würde.

3. Drei Wege, dieselbe Trennung durchzuführen

Die Studie berichtet über drei Prozesse mit derselben Chemie: die Pilot-Batch-Methode, dieselbe Methode downgescaled und MCSGP, basierend auf dieser downgescaleten Methode. Der Vergleich aller drei trennt den Effekt des Betriebsmodus vom Effekt der Säulengeometrie.

4. Von der Batch-Methode zum kontinuierlichen Prozess

MCSGP ist komplexer einzurichten als die Einzelsäulen-Chromatographie, und das Paper stellt fest, dass spezialisierte Prozessentwicklungstools zur Optimierung und Implementierung erforderlich sind. Sein praktischer Beitrag ist ein Verfahren, das bei etwas ansetzt, das ein Prozesschemiker bereits hat – einem fraktionierten Batch-Chromatogramm mit Reinheitsdaten – und dieses in eine laufende Doppelspalten-Methode überführt.

• Durchführung einer Batch-Design-Methode Der downgescalete Batch-Lauf wurde mit einer erhöhten Elutionsflussrate von 200 cm/h wiederholt, um die MCSGP-Leistung zu maximieren, das Eluat fraktioniert und jede Fraktion mittels HPLC analysiert. Das Chromatogramm wurde dann mit den gemessenen Fraktionsreinheiten überlagert.
• Festlegen der Phasengrenzen am Bildschirm Dieses Chromatogramm und seine Reinheitsdaten wurden in den MCSGP Wizard v8.1 hochgeladen. Die Grenzen zwischen den Rezirkulierungs- und Sammelphasen wurden per Drag-and-Drop gegen das Reinheitsprofil festgelegt, um die Reinheit des Produktsammelfensters zu optimieren.
• Softwaregestützte Dimensionierung des Rests Gradientenparameter, die Beladung pro Switch und die In-line-Verdünnungsfaktoren wurden automatisch aus dem importierten Chromatogramm und der relativen Position der Phasengrenzen berechnet. Wasch-, Reinigungs- und Regenerationsschritte wurden in eine Vorlagentabelle eingegeben.
• Ausführen der generierten Methoden Der Wizard erstellte einen Satz von Start-, Haupt- und Shutdown-Methoden, die auf der Contichrom CUBE-Hardware ausgeführt werden konnten.

Was die vier Phasen bewirken

Jeder MCSGP-Switch hat vier Phasen, und die beiden, die die Technik definieren, sind die Rezirkulierungsschritte. In Phase 1 startet ein Gradient auf der ersten Säule, während die zweite parallel gereinigt und regeneriert wird. In Phase 2 werden die Säulen miteinander verbunden und der früh eluierende Seitenschnitt mit geringer Reinheit wird von der vorgeschalteten Säule auf die nachgeschaltete übertragen, wobei eine In-line-Verdünnung den Modifikatorgehalt senkt, damit das Produkt readsorbiert. In Phase 3 laufen die Säulen wieder parallel: Reines Produkt wird von der ersten gesammelt, während die zweite frisches Rohmaterial erhält. In Phase 4 wird der spät eluierende Seitenschnitt mit geringer Reinheit auf die gleiche Weise wie in Phase 2 rezirkuliert. Die Säulen tauschen dann die Positionen und die Sequenz wiederholt sich.

5. Was der 13-Zyklen-Lauf zeigte

Es wurde ein MCSGP-Lauf über 13 Zyklen durchgeführt, der 27 Produktelutionen einschließlich Startup und Shutdown über eine Gesamtlaufzeit von 17 Stunden ergab. Die Zyklenzahl war nur durch die Menge an verfügbarem Rohmaterial für die Studie begrenzt.

Konvergenz

Ein kontinuierlicher Prozess muss sich einpendeln, bevor er beurteilt werden kann, und die Studie verfolgt dieses Einpendeln auf drei Wegen. Die Fläche unter der UV-Kurve für die Produktsammelphase erreichte bis Zyklus 5 einen konstanten Wert, was darauf hindeutet, dass sich die Masse des in das System eintretenden und es verlassenden Produkts im Steady State befand. Die Produktreinheit folgte demselben Muster: Sie beginnt bei 95,6 Flächen-%, sinkt und stabilisiert sich bei etwa 95,1 Flächen-%. Die kritische N-1-Verunreinigung beginnt bei 0,5 Flächen-%, steigt und stabilisiert sich bei etwa 0,7 Flächen-% – innerhalb der Spezifikation von weniger als 1,0 %.

Die Ausbeute pro Zyklus war mit etwa 94–95 % stabil, wobei die Produktrückgewinnung zwischen 127 und 130 mg pro Zyklus lag. Der Shutdown-Schritt lieferte mit 62 % einen deutlich niedrigeren Wert, was ein normales Merkmal von MCSGP ist: Er wird gegen die größere Beladung während des Startups berechnet, und sein Effekt auf den Gesamtwert schrumpft mit steigender Zyklenzahl. Einschließlich Startup und Shutdown betrug die Gesamtausbeute 93 %.

Verunreinigungsakkumulation, beobachtet statt angenommen

Eine gewisse Akkumulation war in dem Bereich feststellbar, in dem stark adsorbierende Verunreinigungen rezirkuliert wurden. Das Paper behandelt dies eher als erwartet denn als alarmierend: Eine Akkumulation von Verunreinigungen in den Rezirkulierungsbereichen ist bei MCSGP typisch und wird erst dann zum Problem, wenn sie sich in den Produktpool erstreckt und dazu führt, dass die Spezifikation verfehlt wird. Dies war hier nicht der Fall, und die angegebene Abhilfe, falls es dazu gekommen wäre, bestünde darin, die Rezirkulierungsfenster während des Prozessdesigns zu verengen und mehr Verunreinigungen in den Abfall zu leiten.

Die Leitfähigkeitsspuren überlagerten sich über den gesamten Lauf reproduzierbar, was auf eine stabile Systemleistung hindeutet. Die Autoren stellen fest, dass die Überwachung der Fläche unter der Kurve von Zyklus zu Zyklus dem Bediener ein Live-Signal gibt: Abweichungen von vordefinierten Grenzwerten können dazu führen, dass ein Lauf angepasst, pausiert oder abgebrochen wird, bevor Zeit und Material verschwendet werden.

6. Vollständige Ergebnisse und Scale-Up

Wischen Sie die Tabelle zur Seite, um alle drei Prozesse zu sehen.

Quelle: Tabelle 4, Weldon, Vandermeersch und Müller-Späth, Org. Process Res. Dev. 2025, 29, 1400–1410 (CC BY). * Der downgescalete Batch wurde nur mittels HPLC-UV bewertet, nicht mittels Massenspektrometrie, daher sind diese beiden Werte nicht strikt mit den anderen vergleichbar.

Die Produktivitätszahl genau lesen

Die Produktivität pro Liter Harz betrug 9,88 g/L_Harz/h für MCSGP gegenüber 10,09 für den downgescaleten Batch – faktisch gleich. Der Gewinn gegenüber dem Pilot-Batch-Prozess mit 5,28 resultiert aus der Betthöhe: Die downgescalete Säule ist halb so hoch, wodurch sich die Verweilzeit während der Elution halbierte und die Produktivität in etwa verdoppelte. In der Praxis ergibt die halbe Betthöhe bei doppelter Produktivität einen ähnlichen Gesamtdurchsatz, da der Durchsatz das Produkt aus Produktivität und Säulenvolumen ist.

Der im Paper berichtete Durchsatzvorteil von 87 % ist ein anderer Vergleich: Ein MCSGP-System betreibt zwei Säulen statt einer bei gleichem Säulendurchmesser. Anders ausgedrückt: Eine Elution im MCSGP war in 38 Minuten abgeschlossen, gegenüber 90 Minuten für eine Batch-Elution an derselben 10-cm-Säule. Drei Faktoren tragen dazu bei: die höhere Ausbeute, die höhere Elutionsflussrate bei MCSGP (200 gegenüber 150 cm/h, was weniger Risiko birgt, da die Rezirkulierung die Ausbeute sichert) und die Tatsache, dass Regeneration, Reinigung und Beladung parallel zur Elution auf der anderen Säule laufen.

Scale-up-Szenarien

Auf dem Contichrom CUBE entwickelte MCSGP-Prozesse sind direkt auf den Contichrom TWIN skalierbar, ein Produktionssystem, das unter GMP-Bedingungen betrieben werden kann. Die Studie projiziert vier Konfigurationen.

Wischen Sie die Tabelle zur Seite, um alle vier Konfigurationen zu sehen.

Quelle: Tabelle 5 der Studie. Dies sind berechnete Scale-up-Szenarien und keine demonstrierten Läufe. Das Paper stellt fest, dass die größte Konfiguration bei 24 Stunden kontinuierlichem Betrieb eine Produktion im Multitonnen-Maßstab pro Jahr ermöglicht.

7. Was dies für die Oligonukleotid-Herstellung bedeutet

Die Schlagzeile ist ein Gewinn von 13 Prozentpunkten bei der Ausbeute, aber das Argument des Papers bezieht sich darauf, was dieser Gewinn upstream bewirkt. Eine höhere chromatographische Ausbeute ermöglicht es, den chemischen Synthese-Batch proportional für den gleichen Produktausstoß zu verkleinern.

Das ist wichtig, da in der Synthese die Rohstoffkosten, die kundenspezifischen Intermediate und die Lösungsmittelbelastung anfallen. Die Autoren berichten, dass MCSGP bei gleichem Produktausstoß 14 % niedrigere Cost of Goods verursacht, und führen die Einsparung auf weniger Rohstoffe und Verbrauchsmaterialien, weniger kundenspezifische Oligonukleotid-Intermediate, kleinere Synthese-Batches und geringere Mengen an Chromatographieharz zurück. Speziell beim Harz berechnen sie, dass ein Einzelsäulen-Batch-System im Produktionsmaßstab 86 % mehr Harz benötigt als MCSGP für den gleichen Ausstoß – und stellen fest, dass diese Zahl den Unterschied möglicherweise noch unterschätzt, da die Batch-Chromatographie normalerweise nicht kontinuierlich betrieben wird.

Neben den gemessenen Prozessverbesserungen führt das Paper eine Reihe von operativen Vorteilen auf, die es durch Automatisierung erwartet: weniger In-Prozess-Kontrollproben und somit ein reduzierter GMP-Analytikaufwand, die Eliminierung der Rechromatographie mit ihren Lagerbeuteln, Gefrierkapazitäten und der Diafiltration, weniger Bedienerinteraktion und weniger Spielraum für Anwenderfehler sowie kleinere Säulen, die einfacher zu packen sind. Diese Punkte werden in dieser Studie eher argumentativ dargelegt als gemessen.

Eine methodische Anmerkung, die man im Hinterkopf behalten sollte: Die Anionenaustauschmethode erreichte hier sowohl im Batch- als auch im MCSGP-Modus eine Reinheit von über 95 %, während NaOH-basierte AIEX-Methoden nach Erfahrung der Autoren typischerweise 88–92 % liefern. Sie vermuten, dass die phosphatgepufferte mobile Phase mit 10 % Acetonitril die Selektivität durch Reduzierung unerwünschter hydrophober Wechselwirkungen verbessert haben könnte, stellen aber auch fest, dass das Rohmaterial bereits mit einer hohen Ausgangsreinheit von 85 % eintrat.

Dieselbe Umwandlung wurde im Reversed-Phase-Modus an einem GalNAc-konjugierten Gapmer durchgeführt, wie in einer Begleitstudie dieser Reihe berichtet. Für die Plattformansicht, wo MCSGP in einen Oligonukleotid-Workflow passt, siehe Oligonukleotid-Reinigung mit MCSGP.

8. Schlüsselbegriffe in dieser Studie (Glossar)

9. Häufig gestellte Fragen