ZWEISÄULEN-POLISHING

MCSGP-Chromatographie: Kontinuierliches Polishing

Zurückgewinnen, was die Batch-Chromatographie zurücklässt.

MCSGP-Chromatographie ist ein präparatives Zwei-Säulen-HPLC-Verfahren, das den Kompromiss zwischen Reinheit und Ausbeute beim Polishing mittels Umkehrphasen- und Ionenaustauschchromatographie aufhebt – gleiches Harz, gleiche Puffer, keine Änderung der Chemie.

Mit der dynamischen Prozesssteuerung AutoPeak® liefert MCSGP Reproduzierbarkeit auf Produktionsniveau auf der Contichrom®-Plattform, validiert im GMP-Maßstab in der Peptid- und Oligonukleotid-Herstellung.

Validiert über 4 PPQ-Läufe: 99,2% Reinheit | −96% In-Prozess-Kontrollen | 235 h unbeaufsichtigter Betrieb | +9% Ausbeutesteigerung

Quelle: Eisenhuth & Müller-Späth, Processes 2025 (Bachem Bivalirudin PPQ-Kampagne, Open Access)

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Warum Batch-Chromatographie einen Reinheit–Ausbeute-Kompromiss erzwingt

Jeder Gradienten-Polierungsschritt unterliegt derselben Einschränkung. Ein enger Mittelschnitt erreicht die Zielreinheit – verwirft jedoch Produkt in den frühen und späten Fraktionen, die den Peak flankieren. Eine Verbreiterung des Schnitts gewinnt dieses Produkt zurück – verfehlt jedoch die Reinheitsspezifikation. Die Lagerung von Seitenfraktionen und deren Wiederaufarbeitung durch zusätzliche Batch-Läufe verbessert die Ausbeute nur zu enormen Kosten: Sie vervielfacht Handhabungsschritte, analytischen Aufwand, Pufferverbrauch und Kampagnendauer.

Dies ist kein Fehler in der Methodenentwicklung. Es ist eine inhärente Limitierung der Einsäulen-Batch-Chromatographie. Wenn Ihr Produkt und seine Verunreinigungen eng eluieren, kann keine Fraktionierungsstrategie gleichzeitig sowohl Reinheit als auch Ausbeute auf einer einzelnen Säule maximieren.

Wie MCSGP den Kompromiss eliminiert

MCSGP (multicolumn countercurrent solvent gradient purification) optimiert nicht den Schnitt – es eliminiert den Kompromiss, indem die unreinen Seitenfraktionen kontinuierlich rezykliert werden, anstatt sie zu verwerfen.

Zwei identische Säulen arbeiten in einem koordinierten zyklischen Prozess. Während eine Säule eluiert, regeneriert die andere und belädt parallel frisches Ausgangsmaterial. Die früh eluierenden und spät eluierenden unreinen Fraktionen – die Seitenschnitte, die Batch-Prozesse sammeln, poolen, lagern und wiederaufarbeiten – werden stattdessen direkt von der ersten Säule zur zweiten Säule mit In-line-Verdünnung übertragen, bereit zur Re-Adsorption und erneuten Trennung im nächsten Wechsel. Produkt verlässt das System nur, wenn es rein ist. Das Ergebnis ist, dass hohe Ausbeute und hohe Reinheit gleichzeitig in einem kontinuierlichen automatisierten Prozess erreicht werden.

Da MCSGP mit demselben Gradienten wie Ihr bestehender Batch-Polierungsschritt arbeitet, gibt es keine Änderung bei Harz, Puffern oder Eluentenzusammensetzung. Ihre Batch-Methode ist der Ausgangspunkt.

Die Leistungsgewinne sind über mehrere validierte industrielle Anwendungen quantifiziert. Sowohl Bachem AG als auch Bristol Myers Squibb haben Ergebnisse über Peptid- und Proteinanwendungen veröffentlicht.

10–50 %

Absolute Ausbeutesteigerung bei Zielreinheit

↓ 75 %

Lösungsmittelreduktion vs. Batch-Prozess

Null

Re-Chromatographie-Läufe, internes Recycling ersetzt Pooling

5 Tage → 24 h

Kampagnendauer (Peptid-API), Bachem, GMP-Produktionsmaßstab

MCSGP-Chromatographie vs. Batch-HPLC: Leistungsvergleich

Die Ausbeute- und Kostenvorteile der multicolumn countercurrent solvent gradient purification gegenüber der konventionellen Single-Column-Batch-Chromatographie werden über mehrere GMP-Herstellungskampagnen quantifiziert.

Kennzahl	Batch-HPLC	MCSGP-Chromatographie
Ausbeute bei Zielreinheit	Baseline	+10–50 % absolute Steigerung
Lösungsmittelverbrauch	Baseline	−75 %
Re-Chromatographie-Läufe	Erforderlich für Seitenfraktionen	Null – internes Recycling
Kampagnendauer (Peptid-API)	5 Tage	24 Stunden
In-Prozess-Kontrollen	Baseline	−96 %
Unbeaufsichtigter Betrieb	Begrenzt	235 h kontinuierlich

Bachem AG Peptid-API-Herstellung, Eisenhuth, R.; Müller-Späth, T. Processes, 2025, (Open Access), Weldon, R. et al. J. Chromatogr. A, 2022 (Open Access). Weldon, R. et al. Org. Process Res. Dev., 2025 (Open Access).

Wie MCSGP-Chromatographie funktioniert: Der Vier-Phasen-Zyklus

Jeder MCSGP-Zyklus besteht aus zwei Wechseln, mit einer Elution von jeder Säule pro Zyklus. Innerhalb eines Wechsels laufen vier Phasen nacheinander ab:

Phase	Vorgeschaltete Säule	Nachgeschaltete Säule
P1 – Elutionsstart	Gradient gestartet; schwach adsorbierende Verunreinigung (W) entfernt	Regeneration abgeschlossen; Vorbereitung für Beladung
P2 – Schwaches Recycling	Säulen verbunden; frühe Fraktionen niedriger Reinheit (W/P) mit In-line-Verdünnung zur Downstream-Säule zur Re-Adsorption übertragen	Empfängt rezyklierte W/P-Fraktion + bindet Produkt
P3 – Produktsammlung	Reiner Produkt-Mittelschnitt (P) gesammelt	Frisches Ausgangsmaterial beladen
P4 – Starkes Recycling	Späte Fraktionen niedriger Reinheit (P/S) mit In-line-Verdünnung zur Downstream-Säule zur Re-Adsorption übertragen	Empfängt rezyklierte P/S-Fraktion + bindet Produkt

Am Ende des Wechsels tauschen die beiden Säulen durch Ventilschaltung ihre Positionen – keine physische Bewegung – und der Zyklus wiederholt sich. Der Prozess erreicht innerhalb von 1–2 Zyklen einen zyklischen Steady State, ab dem Produktqualität und Ausbeute von Zyklus zu Zyklus konsistent sind.

Die In-line-Verdünnung während der Recycling-Phasen (P2 und P4) senkt die eluotrope Stärke der übertragenen Fraktion und stellt sicher, dass das rezyklierte Produkt auf der Downstream-Säule re-adsorbiert, anstatt durchzulaufen. Der Verdünnungsfaktor wird automatisch vom MCSGP-Assistenten aus dem Batch-Chromatogramm berechnet.

Das MCSGP-Prozessprinzip (.pptx)

Methodenentwicklung mit dem MCSGP-Assistenten

MCSGP-Methoden werden im MCSGP-Assistenten in ChromIQ® 9 entwickelt – einer registerkartenbasierten Oberfläche, die ein Batch-Chromatogramm vom Contichrom® CUBE übernimmt und Sie zu einer vollständigen, ausführbaren Methode führt.

Schritt 1 – Batch-Chromatogramm laden und Fraktionsdaten eingeben

Laden Sie den Einsäulen-Batch-Designlauf vom CUBE direkt in den Assistenten. Wählen Sie den UV-Kanal für die Phasengrenzeinstellung. Geben Sie Reinheits- und Konzentrationsdaten aus der Offline-Fraktionsanalyse des Batch-Laufs ein (optional, aber dringend empfohlen). Der Assistent zeigt vorhergesagte Batch-Ausbeute, Reinheit und Produktverlust basierend auf dem geladenen Chromatogramm als Referenz an.

Schritt 2 – Abschnittsgrenzen per Drag-and-Drop definieren

Ziehen Sie fünf vertikale Grenzmarkierungen auf dem Batch-Chromatogramm, um die vier MCSGP-Zonen zu definieren: Start des schwachen Recyclings (t2), Start der Produktsammlung (t3), Ende der Produktsammlung (t4) und Ende des starken Recyclings (t5). Der Assistent aktualisiert vorhergesagte Ausbeute, Reinheit und Produktverlust in Echtzeit, während Sie die Markierungen bewegen – keine manuelle Berechnung erforderlich. Die In-line-Verdünnungsanforderungen für die Recycling-Phasen werden automatisch aus den Grenzpositionen berechnet.

Schritt 3 – Waschen, Regeneration und AutoPeak® konfigurieren

Legen Sie die Schritte für die Säulenwäsche und Regeneration auf der Registerkarte Wäsche & Regeneration fest. Aktivieren Sie die AutoPeak®-Prozesssteuerung auf der Registerkarte „AutoPeak Process Control“ – jeder der vier Phasenübergänge (t2–t5) kann unabhängig voneinander aktiviert werden. Für frühe Entwicklungsläufe mit klar definierten Bedingungen ist eine feste Zeitsteuerung ausreichend. Für Scale-up und ausgedehnte Produktionskampagnen ist AutoPeak® unerlässlich, um eine gleichbleibende Ausbeute und Reinheit zu gewährleisten, wenn sich die Bedingungen ändern. Eine vollständige Konfigurationsanleitung finden Sie unter Dynamische Prozesssteuerung →.

Schritt 4 – Leistungsvorhersage überprüfen und generieren

Das Register Methodeneinstellungen & Leistung zeigt die vorhergesagte Prozessleistung – Produktivität (g/L/h), Lösungsmittelbedarf (L/g), Säulenbeladung (g/L) und Poolkonzentration – vor Initiierung des MCSGP-Laufs. Legen Sie die Anzahl der Zyklen für die Hauptmethode fest und überprüfen Sie die Puffervolumina pro Pumpeneinlass. Klicken Sie auf Speichern: Der Assistent generiert ein vollständiges Methodenpaket einschließlich Startup-, Haupt-, Shutdown- und Clean-Methoden sowie eine Prozedurdatei, die diese in der richtigen Reihenfolge lädt. Öffnen Sie die Prozedur in ChromIQ® und führen Sie MCSGP aus.

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AutoPeak® – Dynamische Prozesssteuerung

Zeitfeste Phasengrenzen funktionieren während der frühen MCSGP-Entwicklung, wenn die Bedingungen gut definiert sind und der Prozess engmaschig überwacht wird. Für Fertigungskampagnen – bei denen Säulenalterung die Retentionszeiten verschiebt, Pufferchargen variieren und der Prozess automatisch über Hunderte von Zyklen laufen muss – ist AutoPeak® unerlässlich.

AutoPeak® ersetzt zeitfeste Phasenübergänge durch Echtzeit-UV-gesteuerte Grenzen. Das UV-Signal am Auslass der eluierenden Upstream-Säule wird kontinuierlich überwacht. Wenn das Signal den definierten Schwellenwert überschreitet – einen absoluten mAU-Wert an der aufsteigenden Peakfront oder einen Prozentsatz des tatsächlichen Peakmaximums dieses Wechsels an der absteigenden Flanke – wird eine neue Prozessphase gestartet. Vier Übergänge können unabhängig gesteuert werden: Start des schwachen Recyclings (t2), Start der Produktsammlung (t3), Ende der Produktsammlung (t4) und Ende des starken Recyclings (t5).

Das entscheidende Detail ist, dass die relativen Trigger (% des Peakmaximums) bei jedem Wechsel neu aus dem tatsächlichen UV-Maximum dieses Wechsels berechnet werden – nicht aus einer festen Referenz. Das bedeutet, dass sich AutoPeak® sowohl an Änderungen der Peakhöhe als auch der Peakposition anpasst. Wenn die Ausgangsmaterialkonzentration sinkt und der Elutionspeak schrumpft, funktionieren die Flanken-Trigger weiterhin am korrekten relativen Punkt. Sammlungsfenster folgen dem Peak, wohin er sich auch bewegt, über die gesamte Säulenlebensdauer, ohne jegliche Bedienereingriffe nach der initialen Konfiguration.

Die Triggerwerte werden aus den am Batch-Chromatogramm gesetzten Abschnittsgrenzen vorab ausgefüllt – keine manuelle Eingabe erforderlich.

Siehe Dynamische Prozesssteuerung → für den vollständigen Mechanismus und Anleitung zu Triggertypen

Ergebnisse verifizieren: Das Evaluation Center

Jeder MCSGP-Lauf wird im Evaluation Center erfasst – ChromIQ®s integriertem Datenanalysemodul.

Zyklusüberlagerung – Überlagern Sie alle Zyklen eines Laufs in einer Ansicht. Aufeinanderfolgende UV-Spuren, die sich nicht mehr ändern, zeigen an, dass der zyklische Steady State erreicht wurde – typischerweise innerhalb von 1–2 Zyklen für MCSGP. Visuelle Bestätigung der Prozesskonsistenz auf einen Blick
Auto-Integration – Verfolgt quantitativ Produktrückgewinnung, Reinheit und Ausbeute für jede Fraktion über jeden Zyklus. Bestätigt, wann der Steady State erreicht ist, und dokumentiert die Leistung pro Zyklus für Prozessaufzeichnungen
Überlagern – Überlagern Sie Läufe aus separaten Dateien, um verschiedene Sollwerte, Harzchargen oder Scale-up-Experimente nebeneinander zu vergleichen
PDF- und Excel-Export – Chromatogramme pro Zyklus, Integrationstabellen und Prozessparameter in einem strukturierten Bericht für Entwicklungsaufzeichnungen zusammengestellt

Das ChromIQ®-Logbuch zeichnet jedes Systemereignis und jeden AutoPeak®-Trigger mit Zeitstempel und auslösendem Wert auf – ein unveränderlicher Audit-Trail jeder Entscheidung, die das System getroffen hat.

Plattformvorteile auf einen Blick

Vorteil	Was es in der Praxis bedeutet
10–50 % absolute Ausbeutesteigerung	Produkt aus Seitenfraktionen zurückgewonnen, die Batch-Prozesse verwerfen – reduziert direkt das pro Charge erforderliche Rohmaterial
Re-Chromatographie eliminiert	Kein Poolen, Lagern oder Wiederaufarbeiten von Seitenfraktionen – QC-Aufwand und Kampagnendauer proportional reduziert
Bis zu 5× Durchsatzgewinn	Paralleler Säulenbetrieb und kleinere Säulen eliminieren Batch-Leerlaufzeiten – mehr Produkt aus derselben Anlagenfläche
Dasselbe Harz und dieselben Puffer	Keine Änderung der chromatographischen Chemie – Ihre bestehenden Batch-Bedingungen sind der Ausgangspunkt für die MCSGP-Entwicklung
24/7 unbeaufsichtigter Betrieb	AutoPeak® erhält konsistente Ausgabequalität ohne Bedieneraufsicht über erweiterte Kampagnen aufrecht
Direkter Scale-up-Pfad	Auf dem Contichrom® CUBE entwickelte Methoden werden direkt auf den Contichrom® PILOT 300X und TWIN HPLC übertragen

Anwendungen der MCSGP-Chromatographie

MCSGP ist auf Gradienten-Polierungsschritte anwendbar, bei denen der Produktpeak mit strukturell ähnlichen Verunreinigungen koeluiert. Zum Beispiel kann MCSGP bei der AAV-Reinigung während der AEX-Polierung eingesetzt werden, um überlappende Leer-/Vollkapsid-Fraktionen zu rezyklieren und die Rückgewinnung von Vollkapsiden zu verbessern.

Molekülklasse	Stationäre Phase	Typische Trennung
Monoklonale Antikörper	Kationenaustausch (CEX)	Ladungsvariantentrennung – saure/basische Isoformen von der Hauptspezies, Aggregat- (HMW) und Fragment- (LMW) Trennung
Bispezifika / Antikörpervarianten	CEX, Mixed-Mode	Komplexe Ladungsvariantenprofile; Entfernung von Halb-Antikörpern, parentalen Antikörpern und fehlgepaarten Spezies
Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs)	Hydrophobe Interaktion (HIC), RP	DAR-Spezies-Trennung; Entfernung unkonjugierter Antikörper
Peptide	Umkehrphase (RP)	Deletionssequenzen, oxidierte Varianten, Entfernung eng eluierender Verunreinigungen
Oligonukleotide	Anionenaustausch (AEX)	n−1 / n+1 Shortmere, Backbone-Varianten, eng aufgelöste Sequenzverunreinigungen
Rekombinante Proteine	CEX, AEX, HIC	PEGylierungs-Isoformentrennung; Aggregat- und Ladungsvariantenentfernung
Kleine Moleküle & Nutraceuticals	RP	Trennung des Zielprodukts von eng eluierenden Verunreinigungen

Empfohlene Systeme für MCSGP-Chromatographie und kontinuierliches Polishing

Die Contichrom®-Plattform bietet sowohl Entwicklungs- als auch Scale-up-Systeme für MCSGP.

Systemübersicht

Contichrom® TWIN HPLC

Produzieren Sie Peptide und Oligonukleotide im kommerziellen GMP-Maßstab. Dieses industrielle 80-bar-HPLC-System nutzt MCSGP mit AutoPeak®, um den Kompromiss zwischen Ausbeute und Reinheit zu eliminieren – dies steigert die Rückgewinnung auf >90 % bei gleichzeitig reduziertem Lösungsmittelverbrauch im Vergleich zum Batch-Verfahren. Zertifiziert nach ATEX-Zone 2 / Class I Div 2 für organische Lösungsmittel und Durchflussraten bis zu 36 L/min.

Contichrom® PILOT

Skalieren Sie die Peptid- und Oligonukleotidreinigung auf die Pilot- und klinische GMP-Produktion. Dieses 100-bar-präparative HPLC-System verfügt über MCSGP mit AutoPeak®, um den Kompromiss zwischen Ausbeute und Reinheit zu eliminieren – und liefert eine absolute Ausbeutesteigerung von +10–50 % bei Zielreinheit und deutlich weniger Lösungsmittel als Batch-HPLC. ATEX Zone 2 / Class I Div 2 zertifiziert für organische Lösungsmittel. Durchflussraten bis zu 300 mL/min.

$Contichrom CUBE system with UV detectors and FOXY fraction collector$

Contichrom® CUBE

Die unverzichtbare Plattform für die Chromatographie-Prozessentwicklung. Dieses vielseitige 100-bar-FPLC-Tischsystem führt Batch-, integrierte Batch- und kontinuierliche Chromatographie – einschließlich MCSGP und CaptureSMB – sofort einsatzbereit aus. Entwickeln Sie Reinigungsprozesse für mAbs, Peptide, Oligonukleotide, ADCs und virale Vektoren – mit verifiziertem Scale-up um über 100× auf Pilot- und Produktionssysteme.

Contichrom TWIN LPLC continuous chromatography system

Contichrom® TWIN LPLC – Feinreinigung

Bringen Sie kontinuierliches Polishing in den biopharmazeutischen Herstellungsmaßstab. Dieses sanitäre GMP-System nutzt MCSGP mit AutoPeak®, um den Kompromiss zwischen Ausbeute und Reinheit zu eliminieren und eine Steigerung der absoluten Ausbeute um +10–50 % bei Zielreinheit zu erreichen, während der Pufferverbrauch im Vergleich zum Batch-Verfahren reduziert wird. CIP-fähiges Design für mAbs, virale Vektoren, ADCs und rekombinante Proteine.

Systemübersicht

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Wofür steht MCSGP, und was ist multicolumn countercurrent solvent gradient purification?

MCSGP steht für multicolumn countercurrent solvent gradient purification. Es ist ein kontinuierlicher Zwei-Säulen-Chromatographieprozess, bei dem zwei Säulen in einem koordinierten Zyklus abwechselnd zwischen Elution und Beladung wechseln, wobei unreine Seitenfraktionen zur erneuten Trennung direkt zwischen den Säulen übertragen werden, anstatt wie bei der Batch-Chromatographie gesammelt, gelagert und erneut aufgearbeitet zu werden. Der Prozess läuft mit demselben Gradienten, Harz und Puffern wie ein konventioneller Single-Column-Polishing-Schritt.

Was ist der Unterschied zwischen CaptureSMB und MCSGP-Chromatographie?

CaptureSMB und MCSGP sind beides Zwei-Säulen-Technologien der kontinuierlichen Chromatographie auf der Contichrom®-Plattform, adressieren jedoch unterschiedliche Schritte. CaptureSMB ist für den Capture-Schritt ausgelegt – das Binden und Eluieren des Zielmoleküls aus geklärtem Harvest – typischerweise unter Verwendung von Protein-A-Harz. MCSGP (multicolumn countercurrent solvent gradient purification) ist für Gradienten-Polishing-Schritte ausgelegt, bei denen das Ziel von eng eluierenden Verunreinigungen wie Ladungsvarianten, Deletionssequenzen oder DAR-Spezies getrennt werden muss. Für die mAb-Herstellung sind die beiden Technologien komplementär: CaptureSMB für Capture, MCSGP für Polishing.

Benötigt MCSGP-Chromatographie andere Harze oder Puffer als mein bestehender Batch-Polierungsschritt?

Nein. MCSGP-Chromatographie verwendet dieselbe stationäre Phase und dieselben Bedingungen der mobilen Phase wie Ihre Batch-Gradienten-Polishing-Methode – Ihr bestehendes Harz und Ihre Pufferbedingungen sind der Ausgangspunkt.

Warum muss das Batch-Chromatogramm vom Contichrom® CUBE stammen?

Der MCSGP-Assistent in ChromIQ® lädt den Batch-Lauf direkt aus der ChromIQ®-Messdatenbank. Chromatogramme von anderen Systemen verwenden unterschiedliche Dateiformate und können nicht importiert werden. Der Batch-Designlauf auf dem CUBE ist typischerweise ein kurzes Einsäulen-Experiment – er ist der Ausgangspunkt für die MCSGP-Entwicklung, kein separater Vorbereitungsschritt.

Wie viele MCSGP-Zyklen sind erforderlich, um den Steady State zu erreichen?

MCSGP erreicht typischerweise innerhalb von 1–2 Zyklen nach der Startup-Phase den zyklischen Steady State. Dies ist schnell im Vergleich zu anderen zyklischen Prozessen, da die Startup-Methode Säule 1 vorlädt, um das Steady-State-Beladungsniveau zu approximieren, bevor die zyklische Hauptmethode beginnt. Die Zyklusüberlagerung im Evaluation Center macht den Steady State sofort sichtbar – aufeinanderfolgende UV-Spuren, die sich nicht mehr ändern, bestätigen, dass er erreicht wurde.

Wann sollte ich AutoPeak® aktivieren und welche Übergänge benötige ich?

AutoPeak® wird während der initialen Prozessentwicklung nicht benötigt, wenn die Bedingungen stabil sind und der Prozess überwacht wird. Es wird unerlässlich für Scale-up und Fertigungskampagnen, bei denen Säulenalterung, Puffervariabilität und Temperaturschwankungen andernfalls dazu führen würden, dass Sammlungsfenster vom Ziel abdriften. Für die meisten Trennungen ist die Aktivierung von t3 (Start der Produktsammlung) und t4 (Ende der Produktsammlung) ausreichend – diese steuern die kritische Grenze um den Produktpeak. Start des schwachen Recyclings (t2) bietet Mehrwert für Trennungen, bei denen die frühe Seitenschnittgrenze ebenfalls driftempfindlich ist. Ende des starken Recyclings (t5) sollte nur für Anti-Langmuir-Peakprofile aktiviert werden. Alle Triggerwerte werden aus den Batch-Chromatogramm-Grenzen vorab ausgefüllt – keine manuelle Berechnung erforderlich.

Was ist der Scale-up-Pfad von der CUBE-Entwicklung zur Fertigung?

Auf dem Contichrom® CUBE entwickelte Methoden werden direkt auf den Contichrom® PILOT 300X (bis zu 300 mL/min, GMP-ready, 21 CFR Part 11, ATEX Zone 2) und von dort auf das Contichrom® TWIN HPLC-Produktionssystem übertragen. Dieselben Abschnittsgrenzen-Positionen und AutoPeak®-Triggerwerte gelten auf jeder Skala – Säulendurchmesser und Betthöhe ändern sich, Methodenparameter erfordern keine Neuableitung.

MCSGP-Ressourcen

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