Validierung von MCSGP: Prozesscharakterisierung und PPQ für die Peptidreinigung

Prozesscharakterisierung und Leistungsqualifizierung von MCSGP

Ralf Eisenhuth und Thomas Müller-Späth

Processes 2025, 13(12), 3950 · Veröffentlicht am 6. Dezember 2025
Sonderausgabe: New Frontiers in Chromatographic Separation Technology
DOI: 10.3390/pr13123950 · Open Access, CC BY

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Interessenkonflikte, wie von den Autoren angegeben: Ralf Eisenhuth war bei der Bachem AG angestellt und Thomas Müller-Späth bei YMC ChromaCon. Die Forschung erhielt keine externe Finanzierung.

Zitation (BibTeX)

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MCSGP reinigt kontinuierlich, indem unreine Seitenfraktionen zwischen zwei Säulen rezirkuliert werden, sodass gleichzeitig eine hohe Ausbeute und eine hohe Reinheit erreicht werden. Dies geschieht durch das Anfahren vordefinierter Recycling- und Sammelfenster, Zyklus für Zyklus, über Stunden oder Tage hinweg – ohne die während des Laufs erfolgende Anpassung der Pooling-Grenzen, die ein Bediener in der Batch-Chromatographie vornehmen kann. Die chromatographische Trennung hat daher einen größeren Einfluss auf die endgültige Produktqualität, und entsprechend mehr Gewicht fällt auf die damit verbundene Kontrollstrategie.

Das macht die Validierung zu einer anspruchsvolleren Aufgabe. Wie weisen Sie in einer behördlichen Einreichung nach, dass ein Prozess, der tagelang mit festen Fenstern läuft, in jedem Zyklus das richtige Material liefert?

Die Studie ist eine Zusammenarbeit zwischen der Bachem AG und YMC ChromaCon mit Bivalirudin als Testsystem. Sie ergänzt eine frühere Charakterisierungs- und Validierungsstudie für CaptureSMB, den einfacheren Zwei-Säulen-Capture-Prozess, und überträgt diese Überlegungen auf die Gradientenreinigung.

1. Warum diese Studie wichtig ist: Eine Lücke zwischen Praxis und Papierkram

MCSGP ist bei mehreren Unternehmen und Forschungsinstituten im Einsatz und reinigt synthetische Peptide und Oligonukleotide im Produktionsmaßstab. Die Vorteile sind gut dokumentiert: Die interne Rezirkulation unreiner Seitenfraktionen ermöglicht es, gleichzeitig eine hohe Ausbeute und hohe Reinheit zu erzielen, bei einem hohen Automatisierungsgrad, weniger In-Prozess-Kontrollen und einer geringeren Prozessmassenintensität als bei der Batch-Chromatographie.

Die regulatorische Validierung ist eine andere Angelegenheit als die Prozessleistung und hat ihre eigene Struktur. Die FDA-Leitlinie zur Prozessvalidierung legt drei Elemente fest:

• Prozessdesign Baut das wissenschaftliche Verständnis des Prozesses auf. Die Prozesscharakterisierung ist das zentrale Stück: Identifizierung der Parameter, die kritische Qualitätsattribute beeinflussen könnten, experimentelles Testen der am höchsten eingestuften Parameter und Definition der Bereiche, innerhalb derer die Qualität erfüllt wird.
• Prozessleistungsqualifizierung (PPQ) Bestätigt, dass die Ausrüstung und der Prozess wie beabsichtigt funktionieren und reproduzierbar im kommerziellen Maßstab produzieren können. Mindestens drei aufeinanderfolgende repräsentative Chargen werden unter normalen Betriebsbedingungen in der tatsächlichen Anlage mit geschultem Personal und qualifizierter Ausrüstung gefahren.
• Fortlaufende Prozessverifizierung (CPV) Laufende Überwachung, sobald die Routineherstellung im Gange ist. Diese Studie deckt die ersten beiden Elemente ab; das dritte liegt außerhalb ihres Rahmens.

Keiner dieser Rahmenbedingungen ist spezifisch für die kontinuierliche Chromatographie, und das Ergebnis der Arbeit ist, dass sie es weitgehend auch nicht sein müssen. Was fehlte, war ein praktisches Beispiel, das zeigt, wie dies auf einen Prozess angewendet wird, dessen definierendes Merkmal – das Recycling von Material zwischen zwei Säulen – keine Entsprechung im Batch-Betrieb hat.

Wo sich MCSGP unterscheidet und wo nicht

Die Arbeit unterteilt die Reinigung in zwei Teile: den chromatographischen Teil, der für Batch und MCSGP identisch ist, und den Produktsammel- und Recyclingteil, der spezifisch für MCSGP ist. Die Liste der Prozessparameter ist daher weitgehend dieselbe wie bei einem Batch-Prozess, mit einigen Ergänzungen, die den Recycling- und Sammelschritt abdecken.

Der praktische Unterschied liegt darin, wie viele Elutionen erforderlich sind, um aussagekräftige Daten zu generieren. Für eine Batch-Reinigung gilt eine Elution pro getestetem Parameter als ausreichend. Ein MCSGP-Experiment benötigt mindestens drei Zyklen mit jeweils zwei Elutionen – genug, um zu bestätigen, dass der Prozess den zyklischen stationären Zustand erreicht hat, dass sich Verunreinigungen nicht durch die schwachen oder starken Recyclingströme anreichern und dass Änderungen der Säulenbeladung durch internes Recycling das Ergebnis nicht beeinflussen.

2. Die Studie auf einen Blick

Als Testsystem wurde Bivalirudin verwendet: ein direkter Thrombininhibitor aus 20 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 2.180 g/mol, hergestellt durch Festphasen-Peptidsynthese und geliefert als Rohmaterial mit 81 % Reinheit. Das Ziel für den Produktpool war eine Reinheit von mehr als 99,0 %, mit der zusätzlichen Einschränkung, dass das Verunreinigungsprofil mit dem herkömmlichen Batch-Prozess vergleichbar sein musste.

Was gefahren wurde und worauf

3. Wie weit die Parameter ausgereizt wurden

Die meisten der 34 identifizierten Parameter wurden nie experimentell getestet, und die Argumentation dahinter ist aufschlussreich. Großtechnische MCSGP-Anlagen halten die meisten Parameter konstruktionsbedingt in engen Grenzen. Ein Contichrom TWIN System verfügt über vier Drei-Kopf-Pumpen – zwei für die Gradientenerzeugung, eine für den Feed, eine für die In-Line-Verdünnung, Cleaning-in-Place und Äquilibrierung – und jede wird durch einen dedizierten Durchflussmesser mit einer Kalibriertoleranz von ±2 % gesteuert.

Ob diese ±2 % von Bedeutung sind, hängt ganz davon ab, was die Pumpe tut. Für Äquilibrierung, In-Line-Verdünnung, Cleaning-in-Place und Chase-Waschschritte ist eine Abweichung von 2 % vernachlässigbar. Für die Säulenbeladung ist sie es nicht: Eine Änderung von 2 % verändert die Peakform, was verschieben kann, was letztendlich in den Recyclingzonen landet. Dieselbe Toleranz macht also einen Parameter gut kontrollierbar und einen anderen potenziell kritisch, und nur für den zweiten ist ein Experiment erforderlich.

Diese Bewertung ließ vier Parameter zum Testen übrig. Jeder wurde dann weit über den Bereich hinaus variiert, den er in der Produktion abdeckt.

4. Was die Prozesscharakterisierung ergab

Jeder Einstellpunkt lieferte ein Produkt oberhalb der Reinheitsspezifikation von 99,0 %. Über alle Charakterisierungsläufe hinweg lag die durchschnittliche Poolreinheit bei 99,30 %, und jeder einzelne Wert fiel in ein Band von ±3 Standardabweichungen, also 99,30 % ± 0,32 %. Da ±3σ etwa 99,7 % der erwarteten Werte bei einer Normalverteilung erfasst, war der Effekt der Parametervariationen statistisch nicht von gewöhnlichem Prozessrauschen zu unterscheiden. Allein aufgrund der Reinheit wären alle vier Parameter als unkritisch eingestuft worden, und der nachgewiesene akzeptable Bereich (PAR) wäre der gesamte charakterisierte Bereich gewesen.

Jeder Eluatpool wurde auch auf einzelne Verunreinigungen untersucht. Diese Profile waren über jeden Lauf konsistent, bis auf einen: Bei −25 % Displacer-Steigung stieg eine einzelne Verunreinigung von unterhalb der Bestimmungsgrenze auf 0,13 % an. Absolut gesehen gering, aber die Spezifikation verlangte, dass das Verunreinigungsprofil mit dem herkömmlichen Prozess vergleichbar sein musste, und das war es nicht mehr.

Auf dieser Grundlage wurde die Gradientensteigung als kritischer Prozessparameter (CPP) eingestuft, und die während der Routineherstellung zulässige Varianz wurde durch organisatorische Maßnahmen reduziert. Säulenbeladung, Elutionsflussrate und Detektionswellenlänge wurden als unkritisch eingestuft. Die Brutto-zu-Brutto-Ausbeuten wurden ebenfalls bewertet; mit Ausnahme des Laufs mit flacher Steigung lagen sie zwischen 60 % und 65 %.

Warum ‚One Factor At A Time‘ statt eines statistischen Versuchsplans

Die Wahl von OFAT gegenüber DoE wird explizit begründet, und die Argumentation ist spezifisch für Peptide. Verwandte Substanzen in einem Peptid verhalten sich tendenziell wie reguläre Proben mit ähnlichem Retentionsverhalten unter Gradientenbedingungen, sodass der primäre beobachtbare Effekt der Parametervariation eher die Breite des Gesamtpeaks als eine Änderung der Auflösung ist. Reinheitsänderungen bei MCSGP resultieren dann tendenziell aus einer Fehlausrichtung zwischen dem Peak und den festen Recycling- und Sammelzonen.

Dies stellt eine praktische Gefahr für einen statistischen Versuchsplan (DoE) dar. Kombinationen, die den Peak kumulativ verbreitern oder verengen – zum Beispiel eine geringere Säulenbeladung mit einer steileren Steigung und einer Wellenlängenverschiebung, die das Signal senkt – können den Peak so weit aus der Ausrichtung mit den festen Zonen schieben, dass der Lauf fehlschlägt, was wiederholte Iterationen des DoE-Setups erzwingt. OFAT lässt keine Wechselwirkungen zwischen Parametern erkennen, was eine echte Einschränkung darstellt, erlaubt aber das Testen viel größerer Bereiche. Für Moleküle mit strengen Reinheitsspezifikationen empfiehlt die Arbeit, die Kombinationen, die die schmalsten und breitesten Peaks erzeugen, als feste Experimente einzubeziehen und kleinere Bereiche in Betracht zu ziehen.

5. Überwachung eines Prozesses, der tagelang läuft

Ein MCSGP-Prozess, der über mehrere Tage kontinuierlich Eluat produziert, stellt ein Probenahmeproblem dar, das die Batch-Chromatographie nicht kennt. Jeden Hauptschnitt separat zu sammeln und zu analysieren, ist im Produktionsmaßstab nicht kosteneffizient, aber eine zu geringe Probenahme lässt den Prozess unbeaufsichtigt. Die Antwort hier ist eine Zwei-Phasen-Strategie.

• Anlaufphase: intensive Überwachung Jeder Hauptschnitt wird durch eine In-Prozess-Kontrollmethode analysiert, bis drei Kriterien für den zyklischen stationären Zustand erfüllt sind – vergleichbare Verunreinigungsprofile für die Hauptschnitte, gute Überlagerung der UV-Spuren auf jeder Säule und vergleichbare Hauptschnittvolumina auf Säulenbasis.
• Stationärer Zustand: strategische Probenahme Sobald diese Kriterien erfüllt sind, sinkt die HPLC-Probenahme auf zwei Proben pro Tag. Die Überwachung stützt sich dann auf drei Elemente zusammen: die strategischen Proben, die Online-UV-Spurüberlagerung und das aufgezeichnete Hauptschnittvolumen pro Säule.

Der Ansatz steht im Einklang mit den Erwartungen an das Risikomanagement für die Produktverfügbarkeit gemäß ICH Q9 (R1).

AutoPeak als Process Analytical Technology

Grundlage der Strategie ist AutoPeak, das die UV-Werte an den Säulenauslässen überwacht und die Recycling- und Sammelphasen über absolute und relative UV-Trigger startet und stoppt, anstatt über die Zeit. Die Grenzen des Hauptschnitts werden als UV-Schwellenwerte in die Steuerung eingegeben. Da die Schnittpunkte dem Peak folgen und nicht der verstrichenen Zeit, verschieben Retentionszeitverschiebungen, die sich über einen langen Lauf ansammeln, die Poolzusammensetzung nicht.

Die Qualifizierungsläufe veranschaulichen dies. Während der PPQ-Charge 1 trat eine leichte Peakverschiebung von Zyklus zu Zyklus auf; als die Spuren auf den AutoPeak-Triggerpunkt neu ausgerichtet wurden, der den Beginn der Produktsammlung markiert, überlagerten sie sich exakt. Auf dieser Grundlage positioniert die Arbeit AutoPeak als Process Analytical Technology im Sinne der FDA-PAT-Leitlinie – eine Einordnung, die durch die FDA-Dokumente zur Prozessvalidierung und PAT sowie durch ICH Q8, Q11 und Q13 unterstützt wird, welche die Echtzeitüberwachung als Teil einer Kontrollstrategie explizit befürworten.

6. Die PPQ-Kampagne: Vollständige Ergebnisse

Zuerst erfolgte ein Pre-PPQ-GMP-Lauf: elf Elutionen, 1,5 kg Rohmaterial gereinigt zu 0,8 kg Zwischenprodukt bei 99,6 % Reinheit, mit einem PMI von 1.402 kg/kg allein für die Reinigung. Die Qualifizierungskampagne umfasste dann vier mehrtägige MCSGP-Läufe, wobei die letzte Charge in zwei Teile aufgeteilt wurde, um eine Reihe von Chargengrößen abzudecken.

Alle vier lieferten konsistente Elutionsprofile, Hauptschnittgrößen und Produktreinheiten. Ein Vergleich der dritten Elution – der ersten im zyklischen stationären Zustand – mit Elution 106 des längsten Laufs zeigte, dass das Verunreinigungsprofil über die gesamte Dauer hielt und die Reinheit für jede vollständige Elution innerhalb des aus der Charakterisierung erwarteten ±3σ-Bandes blieb.

• Rohmaterial-Input 54,5 kg bei 81 % Reinheit
• MCSGP 397 Elutionen über 235 Stunden, Erzeugung von 1.576 L Hauptschnitt
• SPE 42 Elutionen über 65 Stunden auf demselben System und denselben Säulen, abwechselndes Beladen und Eluieren mit einem scharfen Gradienten, Erzeugung von 631 L Hauptschnitt
• API-Output 33,6 kg bei 99,2 % Reinheit – eine Brutto-zu-Brutto-Ausbeute von 62 % oder 76 % effektive Ausbeute unter Berücksichtigung der Produkt- und Rohmaterialreinheit
• Gesamt 300 Stunden chromatographische Betriebszeit

Gegenüber dem herkömmlichen Prozess

Wischen Sie die Tabelle seitlich, um die Spalten für das Legacy-Verfahren und MCSGP zu sehen.

Quelle: Eisenhuth und Müller-Späth, Processes 2025, 13, 3950 (CC BY). Die herkömmliche Zahl bezieht sich auf den bestehenden Bivalirudin-Batch-Prozess, der eine umfangreiche Re-Chromatographie von Seitenschnitten beinhaltet.

Experimentelle Bedingungen

7. Was das für die Peptidherstellung bedeutet

Nach den hier vorliegenden Erkenntnissen muss der regulatorische Rahmen für die kontinuierliche Chromatographie nicht neu erfunden werden. Die Parameterliste entspricht weitgehend der Batch-Liste, die Risikobewertung ist die Standardbewertung und die Qualifizierungsanforderung entspricht der Standarderwartung von mindestens drei aufeinanderfolgenden repräsentativen Chargen. Was sich ändert, ist die Anzahl der Elutionen, die zur Datengenerierung erforderlich sind, und der Wechsel von der Korrektur eines Prozesses hin zu dessen Überwachung.

Dies ist ein nützliches Ergebnis für jeden, der eine kontinuierliche Reinigung gegen den damit verbundenen Validierungsaufwand abwägt. Von 34 identifizierten Parametern rechtfertigten vier Experimente und einer erwies sich als kritisch – und die Arbeit stellt fest, dass dieselben vier auch bei der Charakterisierung des entsprechenden Batch-Prozesses untersucht würden. Der Charakterisierungsaufwand ist vergleichbar; der Unterschied liegt im Materialverbrauch, da der zyklische stationäre Zustand durch aufeinanderfolgende identische Elutionsprofile bestätigt werden muss. In dieser Studie wurde diese zusätzliche Versuchszeit minimiert, indem die erforderlichen MCSGP-Läufe hintereinandergeschaltet und automatisch ausgeführt wurden.

Die betrieblichen Vorteile zeigen sich eher in den Kampagnenzahlen als in der Validierungsargumentation. Der ununterbrochene Betrieb über mehrere Tage, unterstützt durch eine Kontrollstrategie mit Online-Messung, führte zu einer erheblichen Reduzierung der analytischen Probenahme und der Prozessmassenintensität bei gleichzeitig höherer Bruttoausbeute. Die Autoren stellen außerdem fest, dass die Anforderungen an die Datenintegrität und die Handhabung elektronischer Chargenprotokolle für Batch und MCSGP identisch sind.

8. Schlüsselbegriffe in dieser Studie (Glossar)

9. Häufig gestellte Fragen