ENRICHISSEMENT À DOUBLE COLONNE

Chromatographie d’enrichissement continu avec N-Rich®

Isolement automatisé des impuretés à l’état de traces.

 

Accumulez ce qui est à peine présent — enrichissement cyclique pour la préparation de standards de référence, l’isolement de variants de charge et la caractérisation ICH Q3A/Q6B : facteur d’enrichissement 100–1 000× | 80–95 % de pureté en une nuit | entièrement automatisé via l’assistant ChromIQ® N-Rich®.

 

Sources : Bigelow et al. (BMS), J. Chromatogr. A 2021 ; Weldon & Müller-Späth, J. Chromatogr. A 2022

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Le goulot d’étranglement de l’isolement

Les agences réglementaires exigent des standards de référence d’impuretés purs et isolés — pas seulement des pics détectés. Les directives ICH Q3A et Q6B imposent l’identification structurelle et la qualification toxicologique des impuretés à l’état de traces et des variants liés au produit. Le problème est que ces composés existent à 0,1–5 % de l’alimentation, co-éluant avec un pic principal dominant 10–1 000 fois plus abondant.

La HPLC préparative par lots conventionnelle n’a aucun mécanisme pour gérer ce ratio. Des centaines d’injections, un regroupement progressif de fractions diluées, des semaines de traitement — et au final, un matériau qui peut encore être trop impur pour être utilisé comme standard de référence. La synthèse personnalisée coûte des dizaines de milliers de dollars par composé et est tout simplement impossible pour les impuretés biologiques telles que les variants de charge, les glycoformes ou les capsides partiellement remplies qui n’existent que sous forme d’espèces liées au produit.

N-Rich® change ce qui est possible

N-Rich® n’essaie pas d’isoler un composé à l’état de traces en un seul passage. Au lieu de cela, il l’accumule sur colonne sur de nombreux cycles — augmentant progressivement la concentration dans le système jusqu’à ce qu’une quantité suffisante de matériau pur soit disponible pour être collectée en une seule élution finement fractionnée.

Chaque cycle d’enrichissement ajoute davantage de la cible à la colonne tout en éliminant simultanément le composé principal dominant vers les déchets. Après un nombre suffisant de cycles, la cible a été concentrée au point où elle peut être éluée et fractionnée avec une pureté qui serait impossible à l’abondance d’origine. Le processus fonctionne de manière entièrement automatisée et sans surveillance — pendant la nuit, ou sur plusieurs jours pour les cibles à très faible abondance.

Les résultats des applications validées sont cohérents :

95 % de pureté

Variants de charge d’anticorps monoclonaux en 10 h contre 300 h par HPLC (BMS)

3 jours

contre plus de 30 jours pour les anticorps monoclonaux biosimilaires, 9 isoformes



79×

Gain de productivité pour l’isolement d’impuretés peptidiques


69×

Réduction de solvant par rapport à la HPLC analytique



Sources : Bigelow et al. (BMS), J. Chromatogr. A 2021 · Weldon & Müller-Späth, J. Chromatogr. A 2022

N-Rich® est un outil fondamentalement différent du MCSGP. Le MCSGP purifie un produit principal en éliminant les impuretés latérales — son matériau de départ est déjà relativement pur. N-Rich® accumule vers un composé qui commence à l’état de traces et qui pourrait ne jamais être résoluble en une seule passe sur colonne. Les deux utilisent la même plateforme à double colonne et une structure d’assistant ChromIQ® similaire ; le problème qu’ils résolvent est différent.

Comment N-Rich® fonctionne… Partie 1

N-Rich® s’exécute en une seule procédure ininterrompue à travers quatre étapes séquentielles :

Étape Ce qui se passe Durée
Conception Chargement du chromatogramme par lots, définition des limites de recyclage, génération de la méthode Configuration unique
Enrichissement n cycles d’accumulation cyclique — le composé cible s’accumule sur colonne, le composé principal est éliminé à chaque cycle n cycles jusqu’à ce que suffisamment d’alimentation soit traitée
Épuisement Un seul basculement sans nouvelle alimentation — le composé principal restant est éliminé, la cible est concentrée avant l’élution 1 basculement
Élution fractionnée Gradient peu profond sur les deux colonnes en série — la cible est éluée et finement fractionnée pour la collecte Événement d’élution unique

Principe du processus N-Rich® (.pptx)

Comment N-Rich® fonctionne… Partie 2

Dans chaque cycle d’enrichissement, deux basculements alternent. Chaque basculement se compose de quatre phases s’exécutant en parallèle sur les colonnes amont (élution) et aval (régénération/chargement) :

Phase Colonne amont Colonne aval
P1 – Élution des non-cibles (Parallèle) Les non-cibles faiblement adsorbantes sont éluées vers les déchets Régénérée et rééquilibrée
P2 – Recyclage faible (W) (Interconnecté) Les composés cibles faiblement adsorbants sont transférés avec dilution en ligne vers la colonne aval Reçoit la fraction W — la cible se réadsorbe
P3 – Élimination du composé principal (Parallèle) Le composé non-cible (principal) est élué vers les déchets Chargée avec une nouvelle alimentation — plus de cible entre dans le système
P4 – Recyclage fort (S) (Interconnecté) Les composés cibles fortement adsorbants sont transférés avec dilution en ligne vers la colonne aval Reçoit la fraction S — la cible se réadsorbe

Comment N-Rich® fonctionne… Partie 3

À la fin de chaque basculement, les deux colonnes échangent leurs positions par commutation de vanne et le cycle se répète. Le volume d’alimentation par cycle est calculé automatiquement par l’assistant N-Rich à partir du chromatogramme par lots.

L’étape d’épuisement (un basculement, pas de nouvelle alimentation) transfère tout matériau enrichi restant de la colonne amont vers la colonne aval avant l’élution, minimisant le composé non-cible dans les fractions finales et améliorant la pureté finale.

L’élution fractionnée utilise un gradient peu profond sur les deux colonnes en série — à la moitié du débit normal avec un gradient plus plat que la méthode par lots — pour maximiser la résolution entre les composés enrichis. C’est là que le matériau cible concentré et pré-enrichi est collecté sous forme de fractions fines.

Conception de la méthode avec l’assistant N-Rich®

Les méthodes N-Rich® sont conçues dans l’assistant N-Rich® de ChromIQ® 9 — une interface à onglets qui prend un chromatogramme par lots à colonne unique du Contichrom® CUBE et vous guide vers une méthode complète et prête à l’emploi. Comme pour le MCSGP, le chromatogramme par lots est l’entrée essentielle du CUBE.

Étape 1 — Charger le chromatogramme et définir les limites de recyclage

Chargez l’exécution de conception par lots à colonne unique du CUBE dans l’onglet Chromatogramme par lots. Faites glisser cinq marqueurs de limite (t1–t5) pour définir les cinq zones : région de chargement/lavage, zone de recyclage faible (W), zone de composé principal (P), zone de recyclage fort (S) et région de stripage. Ces limites définissent exactement quelles parties du chromatogramme sont recyclées pour enrichir les composés cibles et lesquelles sont envoyées aux déchets à chaque cycle.

Étape 2 — Configurer le lavage, la régénération et le contrôle d’élimination du produit

Définissez les étapes de lavage et de régénération dans l’onglet Lavage & Régénération — le même protocole que votre processus par lots existant. Dans l’onglet « AutoPeak® », activez le Contrôle d’élimination du produit si nécessaire. Lorsqu’il est activé, le début de l’élimination du composé principal est déclenché par UV plutôt que par le temps — Contrôle avant (seuil mAU absolu) si la limite d’élimination tombe sur la pente ascendante du pic, Contrôle arrière (% du maximum du pic) si sur la pente descendante. L’arrêt de l’élimination reste basé sur le temps.

Étape 3 — Configurer le fractionnement final

L’onglet Fractionnement final définit l’élution par gradient peu profond et la collecte de fractions pour l’étape d’élution fractionnée. Le bouton « Calcul automatique des conditions d’élution » (activé par défaut) calcule automatiquement les paramètres d’élution à partir du chromatogramme par lots — la moitié du débit normal, un gradient plus faible, une longueur de gradient doublée sur les deux colonnes en série. Ajustez la taille des fractions et les heures de début/fin. L’aperçu montre le profil d’élution final attendu sur deux colonnes en série.

Étape 4 — Définir le nombre de cycles et générer

Dans l’onglet Paramètres de la méthode & Performance, définissez le nombre de cycles d’enrichissement et examinez les durées de basculement et de cycle. Cliquez sur Enregistrer : l’assistant génère les fichiers de méthode et un fichier de procédure qui les exécute dans la séquence correcte. Chargez la procédure dans ChromIQ® et exécutez. Le processus s’exécute de manière entièrement autonome à partir de là.

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AutoPeak® — Contrôle d’élimination du produit

L’implémentation d’AutoPeak® de N-Rich est distincte de celle du MCSGP. Dans le MCSGP, AutoPeak® contrôle jusqu’à quatre limites de collecte de fractions autour d’un pic de produit principal. Dans N-Rich®, AutoPeak® contrôle une seule transition : quand commencer à éliminer le composé principal pendant la phase d’enrichissement.

Pendant chaque basculement, le composé principal (non-cible) doit être activement détourné vers les déchets au bon moment pour éviter son accumulation. Lorsque AutoPeak® est désactivé, ce détournement se produit à des moments fixes t3 et t4 dérivés du chromatogramme par lots. Le timing fixe est approprié lors du développement précoce de la méthode avec des conditions stables et bien caractérisées.

Avec AutoPeak® activé, le début de l’élimination est déclenché par UV. Si la limite d’élimination (t3) se situe sur la pente ascendante du pic du composé principal, l’élimination est déclenchée par un seuil mAU absolu (Contrôle avant). Si t3 se situe sur la pente descendante, l’élimination est déclenchée par un seuil relatif exprimé en pourcentage du maximum du pic (Contrôle arrière). Dans les deux cas, l’élimination s’arrête après une fenêtre temporelle fixe (t4 − t3) — l’arrêt est basé sur le temps, et non déclenché par UV.

Une fenêtre de détection de seuil agit comme une marge de sécurité : si le déclencheur UV n’est pas atteint dans cette fenêtre étendue, le processus se fige avant la phase suivante plutôt que de se poursuivre aveuglément — garantissant que le matériau accumulé n’est jamais compromis par un déclencheur manqué lors d’exécutions multi-jours sans surveillance.

Vérification des résultats : le centre d’évaluation

Chaque exécution N-Rich® est enregistrée dans le Centre d’évaluation — le module d’analyse de données intégré de ChromIQ®.

  • Superposition des cycles — Superposez tous les cycles d’enrichissement dans une seule vue. Le signal UV du composé cible devrait augmenter progressivement au fil des cycles tandis que le signal du composé principal diminue — confirmation visuelle que l’accumulation se déroule comme prévu.
  • Intégration automatique — Suit quantitativement les zones de fraction enrichies à travers chaque cycle, confirmant le taux d’accumulation et documentant quand le plateau d’enrichissement a été atteint.
  • Superposition — Superposez le chromatogramme de conception par lots avec le résultat de l’élution fractionnée finale — la comparaison côte à côte montre directement à quel point le composé cible a été enrichi par rapport au composé principal.
  • Exportation PDF et Excel — Chromatogrammes par cycle, résultats d’intégration automatique et tableaux de fractionnement compilés dans un rapport structuré.

Avantages de la plateforme en un coup d’œil

Avantage Ce que cela signifie en pratique
Facteur d’enrichissement de 100 à 1 000× Les composés à l’état de traces à 0,1–5 % de l’alimentation sont concentrés à haute pureté en une seule exécution automatisée
Jusqu’à 80× plus rapide que la HPLC analytique Des heures ou des jours au lieu de semaines — fonctionnement de nuit pour de nombreuses applications
3 jours contre plus de 30 jours Isolement d’isoformes d’anticorps monoclonaux biosimilaires : terminé en 3 jours, 50 échantillons analytiques contre >600
95 % de pureté — 30× plus rapide que la HPLC Variants de charge d’anticorps monoclonaux : 95 % de pureté en 10 heures contre 300 heures par HPLC analytique
Jusqu’à 69× de réduction de solvant Même résultat d’enrichissement avec une consommation de phase mobile et des déchets considérablement réduits
Même résine et mêmes tampons Aucun changement des conditions de phase stationnaire ou de phase mobile — vos conditions de lots existantes sont le point de départ
Entièrement sans surveillance La procédure s’exécute de nuit ou sur plusieurs jours sans supervision de l’opérateur — AutoPeak® maintient une performance d’épuisement constante
Chemin de mise à l’échelle Les méthodes développées sur le Contichrom® CUBE sont transférées vers le Contichrom® PILOT 300X et le TWIN HPLC pour un débit plus élevé

Applications N-Rich®

N-Rich® est applicable partout où un composé cible existe en faible abondance par rapport à une espèce co-éluant dominante et ne peut pas être isolé à une pureté ou une quantité utile par les méthodes par lots conventionnelles.

Classe de molécule Cible typique Cas d’utilisation
Anticorps monoclonaux Variants de charge acides et basiques (généralement 5–25 % de l’alimentation) Standards de référence pour les études de dégradation forcée, la comparabilité des biosimilaires, le développement d’essais de puissance
Anticorps monoclonaux biosimilaires Isoformes multiples de 1,5 % à 56 % de l’alimentation Panel complet d’isoformes en 3 jours — toutes les isoformes principales d’un anticorps monoclonal biosimilaire isolées simultanément
Conjugués anticorps-médicament (ADC) Espèces DAR 1 – 7 de la distribution DAR Matériau de référence pour la caractérisation PK/PD et toxicologique des espèces DAR individuelles
Peptides Séquences de délétion, variants oxydés, impuretés de processus à élution proche Standards de qualification ICH — >50× d’augmentation de productivité et >50× de réduction de solvant par rapport à la HPLC analytique
Oligonucléotides Shortmers n−1, longmers n+1, variants de squelette des thérapies dsRNA 15× d’augmentation de pureté, 20× d’enrichissement massique
Protéines recombinantes Isoformes de PEGylation, variants de processus co-éluant Préparation de standards de référence à une pureté et une concentration plus élevées que ce que permettent les méthodes par lots
Nutraceutiques / produits naturels Composés bioactifs à faible abondance dans des matrices complexes Enrichissement sélectif à partir d’extraits naturels sans nécessiter d’étapes d’affinité
Page des applications N-Rich

Systèmes recommandés pour l’enrichissement continu (N-Rich®)

La plateforme Contichrom® propose des systèmes de développement et de mise à l’échelle pour N-Rich®.
Contichrom PILOT preparative HPLC system for continuous chromatography

Contichrom® PILOT

Passez à l’échelle pilote et à la fabrication GMP clinique pour la purification des peptides et des oligonucléotides. Ce système de CLHP préparative 100 bar intègre MCSGP avec AutoPeak® pour éliminer le compromis rendement-pureté — avec +10 à 50 % d’augmentation absolue du rendement à la pureté cible et nettement moins de solvant que la CLHP en batch. Certifié ATEX Zone 2 / Class I Div 2 pour solvants organiques. Débits jusqu’à 300 mL/min.

Contichrom CUBE multi-column FPLC chromatography system with UV detectors and FOXY fraction collector

Contichrom® CUBE

La plateforme essentielle pour le développement de procédés de chromatographie. Ce système FPLC de paillasse polyvalent de 100 bars exécute la chromatographie en mode batch, batch intégré et continu — incluant MCSGP et CaptureSMB — dès la mise en service. Développez des procédés de purification pour les mAbs, peptides, oligonucléotides, ADCs et vecteurs viraux, avec une mise à l’échelle vérifiée de plus de 100× vers les systèmes pilotes et de production.

Contichrom TWIN preparative HPLC chromatography system

Contichrom® TWIN HPLC

Produisez des peptides et des oligonucléotides à l’échelle GMP commerciale. Ce système HPLC industriel à 80 bar utilise le MCSGP avec AutoPeak® pour éliminer le compromis rendement-pureté — en augmentant la récupération à >90 % tout en réduisant la consommation de solvant par rapport au batch. Certifié ATEX Zone 2 / Classe I Div 2 pour les solvants organiques, avec des débits jusqu’à 36 L/min.

Aperçu des systèmes

Services & Support

Réservez une démonstration pour voir comment N-Rich® + AutoPeak® peut être rapidement mis en œuvre dans votre boîte à outils de purification — via un webinaire ou visitez notre site à Zurich.

Études de faisabilité
Études de faisabilité

Comparaison de performances quantifiée. Testez votre molécule sur nos systèmes Contichrom® et comparez CaptureSMB® ou MCSGP à votre procédé discontinu existant.

Location de systèmes
Location de systèmes

Essayez un système Contichrom® dans votre propre laboratoire avant de vous engager à l’achat. Support technique complet et formation inclus — évaluez la technologie selon vos conditions.

Modélisation de procédés
Modélisation de procédés

Modèles mécanistes calibrés construits à partir de vos données de lots — simulez et optimisez les procédés batch, MCSGP ou CaptureSMB® par calcul, avant de réaliser une seule expérience.
Démos et introductions
Démos et introductions

Découvrez le Contichrom® en action. Sur site, dans nos installations ou à distance — profitez d’un aperçu direct des capacités de nos systèmes de chromatographie et de nos logiciels.

Isolez l’intouchable. En une nuit.

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Foire aux questions

Ressources associées

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  • Publications à comité de lecture
Obtention de variants de charge acides et basiques à l’aide d’un système de chromatographie continue à deux colonnes, Protein Expr. Purif.
Publications à comité de lecture 15 Déc 2022

Obtention de variants de charge acides et basiques à l’aide d’un système de chromatographie continue à deux colonnes, Protein Expr. Purif.

Une méthode de chromatographie continue à deux colonnes permet la séparation et la collecte simultanées des variants de charge d’anticorps monoclonaux (mAb) acides et basiques en une seule opération continue.

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